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人乳頭瘤病毒（HPV）相關宮頸癌是婦女癌癥死亡的主要原因，發生轉移的患者預后較差。因此，新的治療方法和使用有效的分子標記對患者進行分層十分重要。這篇2022年10月發表在Nature Communications上的文章，作者對643例宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）進行多組學數據分析，數據集包括來自美國，歐洲和撒哈拉以南非洲的患者樣本。鑒定到兩種預后不同的CSCC亞型（C1和C2）。C1和C2可能是由宮頸癌中最常見的HPV類型（16和18）中的一種引起的，雖然HPV16和HPV18在C1和C2中過表達但是組間預后差異不是由HPV類型引起的。其中C2亞型占比CSCC總數的五分之一，特征為基因組突變顯著，免疫檢查點基因表達增加且腫瘤免疫微環境的差異。總的來說，作者在來自三個不同地理位置的數據集中鑒定到兩種與治療相關的CSCC亞型。
結果：
1.宮頸鱗狀細胞癌兩個基因表達簇的鑒定
本研究納入分析的數據集臨床特征如表1所示，共包括來自美洲，歐洲和烏干達的5個數據集，其中TCGA數據集為訓練集，其余數據集為驗證集。使用TCGA數據集中排名前10的高度可變基因進行一致性聚類，聚為2類時效果最好（圖1a），其中C1亞組包括175例樣本，C2亞組包括61例樣本。對兩個亞組進行差異分析鑒定到938個DEGs（圖1b）。單因素生存分析表明C2亞組的預后較差（圖1c）。Cox回歸分析表明C2亞組是獨立預后因子（圖1d和表2）。此外，KM分析表明當只考慮HPV16+患者時 C1亞組的生存期較好（圖1e）。
2.獨立SCC數據集中鑒定C1和C2亞型及其預測預后
為了進一步驗證C1和C2亞型與OS的關系，作者對上文提到的驗證集進行分析。作者基于129個Cpg位點（MVPs）使用SVM構建分類模型并鑒定到C1和C2亞型之間的甲基化差異（圖2a和2b）。基于MVPs的t-SNE聚類可以將C1和C2亞型分開（圖2c）。單因素分析表明，歐洲數據集中C2亞型的DSS較低（圖2d）然而Cox回歸分析表明C2是DSS的獨立預后因子（表2和圖2e）。C1和C2亞型3年疾病特異性生存率為81%和72%，C1和C2亞型5年疾病特異性生存率為79%和66%。
3.C1/C2亞型與已有亞型之間的關系
作者將C1/C2亞組與已有亞型進行比較（圖3），包括基于多組學數據的亞型和基于轉錄組數據的亞型。其中C1亞型與mRNA-C2亞型和角蛋白含量高亞型的重疊較多，C2亞型與mRNA-C3亞型和角蛋白含量低亞型的重疊較多。
4.亞型的基因組分析
隨后，作者分析C1/C2亞型在基因組水平上的差異。腫瘤的TMB中位數為2.04/Mb，C1亞型為2.11/Mb，C2亞型為1.82/Mb。各個基因的突變頻率如圖4所示。在排除高突變樣本后作者進行dNdScv分析來監督顯著突變基因（smg）（圖4）。共鑒定到34個smg，其中藍色列為C1中顯著突變的smg，紅色列為C2中顯著突變的smg。
5.C2亞型的Hippo通路改變和YAP1活性增加
作者鑒定到的兩個smg（LATS1和NF2）是HIPPO信號通路的核心成員，而smg（FAT1，JUB和STK11）是已知的HIPPO信號通路調節因子。拷貝數數據分析鑒定到211個病灶候選拷貝數變異（CNAs），通過二項回歸鑒定到5個離散CNAs，這5個CNAs在C1和C2亞組的頻率不同（圖5a），在C2中的頻率較高。RPPA數據分析表明C2亞組中YAP1蛋白表達水平較高（圖5b）。作者的結果表明，發生YAP1擴增的樣本其YAP2的mRNA和蛋白表達水平增加。
6.C1/C2亞型的腫瘤微環境差異
在宮頸癌患者中，循環的HPV反應性T淋巴細胞和腫瘤浸潤性細胞毒性T淋巴細胞與N分期較低和改善預后有關。作者使用DNA甲基化數據集比較TCGA腫瘤的細胞組成并研究亞組中多種細胞類型比例的差異（圖6a）。C2亞型中CD8+ T細胞顯著下降而中性粒細胞和CD56+ 自然殺傷細胞顯著升高。（圖6b）。驗證集的C1亞型和C2亞組的細胞類型比例差異類似，其中C2亞型中CTL較少而中性粒細胞，NK細胞和內皮細胞水平較高。
7.C1和C2亞型間質成纖維細胞表型差異
Metascape基因富集分析表明C2亞型的EMT增加，EMT標記基因集中有52個基因上調表達。以上結果表明，C2亞型，TCGA定義的EMT簇和RPPA數據的EMT簇之間具有較大重疊（圖3）。scRNA-seq數據集分析表明間充質基因特征不是來源于腫瘤細胞而是來自間質成纖維細胞并在形成腫瘤免疫微環境中發揮重要作用。C2亞組中癌癥相關成纖維細胞（CAFs）的標記基因FAP和SERPINE1的表達增加（圖5b）。MethyICIBERSORT分析表明C1和C2亞型中成纖維細胞比例類似（圖6a和6b），基于最近有關腫瘤微環境中CAFs異質性的程度和預后的研究，作者假設C1和C2亞型中CAF表型可能有所不同。作者使用已有研究的8個基因集的表達水平進行分層聚類，其中C2亞型聚到一起并且與炎癥CAF表型相關的促炎基因表達增加而與肌成纖維細胞CAF表型相關的收縮基因在C1種表達水平較高（圖6c）。
結論：
總的來說，作者鑒定到CSCC的兩個亞型C1和C2，其中C1亞型的預后較好。盡管HPV16和HPV18可能與C1和C2亞型有關但是HPV類型并不是獨立預后因子。盡管本研究納入了不同地理位置的數據集，但是作者的研究表明不同地理位置的患者C1和C2亞型的關鍵分子和細胞特征類似。
