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現在我們已經進入單細胞數據的時代了，而大家最關心的應該是和自己科室相關的話題了。不同臨床科室面對的科學問題千差萬別。毫無疑問，在各個科室要開展單細胞課題，需要結合文獻案例來付出更多的時間來參悟， 在這里我以人體八大系統為基礎并結合案例來看一看單細胞課題在各類科室如何展開~
目錄（上）
一、單細胞優勢及開展流程
二、心血管科
三、呼吸科
四、運動關節科
五、神經科
一、單細胞優勢及開展流程
使用傳統的基因表達分析技術，如定量PCR、微陣列、RNA測序，但是這些測量很有可能產生誤差，尤其是在具有高度異質性的不同細胞類型。當然在對細胞膜蛋白標記定義的多種細胞類型的樣本進行分析時，也可以首先使用熒光或磁珠輔助的方法對靶細胞群體進行分類，并單獨進行分析，但這樣費錢啊~ 而且不能完全辨別細胞異質性的全譜。因為一個細胞群體往往是異質性的。比如你想研究某個細胞群的基因表達狀態，想測它的mRNA，看表達譜。問題是，細胞群不可能都有相同的基因變異，而且不太可能都處于相同的狀態（不如細胞周期、分化狀態等）。那么用傳統方法去測，弄出來的數據不能精細代表每一簇細胞，一些稀有的亞型的特征或者比較重要的狀態就會被抹平。單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術的出現，通過高分辨率和深度分析樣本中的每個細胞的轉錄組，解決了這一局限。scRNA-seq能夠非常高的分辨率和準確性對細胞異質性進行評估，識別新的細胞狀態和群體，并闡明發育和分化過程中的動態細胞轉變。由于這些原因，scRNA-seq技術對各個研究領域產生了深遠影響。如癌癥，發育，進化，免疫等領域單細胞都是解析異質性的一大利器。
下面我介紹一下單細胞測序的工作流程
單細胞RNA測序的一般實驗工作流程始于將感興趣的器官或組織解離為活的單細胞，這需要一個微小的消化方案，使細胞數量和細胞質量最大化，同時將消化持續時間和細胞死亡降至最低。培養的細胞同樣被分離并制備成單個細胞。然后，通過各種單細胞捕獲方法捕獲準備好的細胞。對單細胞RNA進行逆轉錄，然后進行PCR擴增和文庫制備。隨后進行下一代測序以產生讀數，這些讀數與參考基因組對齊，處理以進行質量控制，最后進行分析。
二、心血管科 · 單細胞
心臟異常和疾病對人類健康的無情威脅促使人們尋求對心臟的新知識。細胞異質性成為心臟生理學和病理學機制研究中的一個主要焦點。成人心臟的細胞復雜性還有很多未知之處。最近的研究解釋了某些細胞類型在心臟生理學和疾病中的功能。例如，巨噬細胞(MPS)被發現可以促進電傳導，并在小鼠心臟衰老和心肌梗死中發揮重要作用。人類心臟細胞圖譜中仍然缺乏，這可能是與人類心臟組織的可獲得性有限有關。在這里我介紹一篇人類心臟組織的單細胞測序相關的文章。
文獻案例：《單細胞重建成人心力衰竭和恢復期間的細胞圖譜》[2]
這篇文章發表在期刊: Nature Cell Biology，這本期刊在最近一年的影響因子為 28.824。中科院大類: 生物學 1區 中科院小類: 1區 細胞生物學。
結果解讀：
作者使用了兩種分離方法：富含CM-enriched消化法和regular消化法，前者產生高質量和高純度的CMs，后者最適合剩下的心肌細胞類型。優化的CM分離方法獲得了典型的桿狀形態、高活力、清晰的條紋和具有CM標記α-Actinin2的細胞。為了全面了解正常成人心臟的細胞組成，作者使用無監督聚類t-SNE對細胞進行劃分，并根據其各自的分子特征將整個群體分為5種主要細胞類型，包括心肌細胞（CMs）、內皮細胞(ECs)、成纖維細胞(FBS)、巨噬細胞（MPs）和平滑肌細胞（SMCs）。
為了深入了解心房（A）和心室CMs（V）之間的分子差異，作者應用非監督聚類對t-SNE識別的所有3894個CMs進行了劃分。心房和心室CMs各形成五個不同的亞群(LA1-5和LV1-5)；房室群(LA和LV中都有的細胞)是唯一的例外。免疫組織化學染色證實LA CM亞簇(LA1和LA2)和LV CM亞簇(LV1和LV3)的存在。接下來，作者檢查了LV CMs、LA CMs和AV共享CMs中的DEGs。雖然LA CMs和LV CMs都表現出獨特的表達模式，反映了它們的功能，但AV CMs沒有表現出顯著的功能富集。LA CMs和LV CMs對肌肉收縮的影響最大，然而，收縮相關基因的表達譜在這兩個compartment之間是不同的。LV CMs在代謝過程中表現出顯著的富集。相比之下，LA CMs更多的參與在細胞信號和通訊、發育和免疫過程中。
由于NCMs已知在心臟內穩態和紊亂中起關鍵作用，作者試圖確定其在成人心臟中的組成。通過t-SNE將ECs、FBS、MPS和SMC分別劃分為4、3、3和4個亞簇。亞簇相對均勻地分布在LA和LV之間。GO分析表明，EC亞簇3(EC3)富集到與核糖體生物發生、細胞因子產生和趨化因子分泌相關的功能，而EC4與免疫應答、細胞-基質粘附和細胞連接組裝相關。通用EC標記PECAM1與EC3標記ACKR1的共同定位證實了該EC亞型的存在。此外，MP2與免疫反應高度相關，而MP3則參與電偶聯。FB1和SMC1都與細胞外基質組織有關，這表明在成人心臟中這兩種細胞類型之間存在功能重疊。FB1與LA中其他細胞類型的相互作用頻率最高，而EC3(ACKR1+)在左心室中的頻率最高，這表明這些亞型利用不同的細胞相互作用網絡和細胞中樞來維持體內平衡。
小編總結：
作者在LA和LV中發現了意想不到的CM多樣性，其特征是在每個亞型中優先表達細胞表面標記、分泌蛋白、細胞骨架基因和轉錄因子。不同的亞群也表達了一組不同的與收縮和代謝相關的基因，這表明這些亞群在維持心臟功能方面具有不同的作用。在今后的研究中，系統地確定CM和NCM亞簇在生理和疾病中的空間定位和功能將是非常重要的。
三、呼吸科 · 單細胞
肺是呼吸系統中最常見的器官，肺發育是一個復雜而微妙的過程，由多達40種細胞類型的空間和協調的促進發育形成。肺細胞系的發育起源和異質性一直是幾十年來研究的焦點。然而，由于肺組織存在復雜性和異質性，研究單個細胞類型中基因表達的細微變化時非常困難。快速發展的單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術能夠對生物過程中的復雜細胞動力學進行觀察。
文獻案例：《單細胞RNA測序顯示早期肺腺癌（攜帶EGFR突變）異質性腫瘤和免疫細胞群》[3]
這篇文章發表在期刊: Oncogene，在最近一年的影響因子: 9.867，中科院大類: 醫學 1區
中科院小類: 1區 生化與分子生物學。
結果解讀：
經10×Genomics單細胞3’rna文庫構建和測序后，從組織中制備單細胞懸液，構建scrna-seq文庫。作者對所有7個腫瘤樣本和5個匹配的肺組織的單細胞進行了無監督的聚類，并用UMAP對其進行可視化處理，檢索到32個不同的簇。為了鑒定不同的細胞類型，作者分析了典型標記在每個簇中的表達以及差異表達基因的富集。這樣就可以將這些細胞群分為腫瘤細胞、支氣管/肺泡上皮細胞、髓樣細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、癌相關成纖維細胞、內皮細胞和肥大細胞。
由于免疫成分可以對腫瘤的發生和發展起到至關重要的影響，作者研究了LUAD早期樣本中免疫浸潤的特征。作者將所有的髓系細胞分成14個不同的亞群，發現大多數(~90%)的髓系細胞是表達CD68的巨噬細胞。與正常組織中的巨噬細胞相比，TAMs高表達APOE和SPP1。TAMs中富集的DEGs與細胞外基質分解、低氧反應、正向調節膽固醇外流以及對腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素1B(IL1B)的反應等途徑有關。然后作者用抗CD68和抗Ki67抗體通過免疫組化證實了這些增殖性巨噬細胞的存在。為了了解LUAD早期TAMs的極化，作者檢測了傳統的經典活化巨噬細胞(M1)和替代活化巨噬細胞(M2)特征基因在這些簇中的表達。腫瘤組織和正常肺組織的巨噬細胞均未表現出特異性的M1或M2特征。但是，它們具有M1和M2簽名基因的類似表達水平。雖然早期LUAD中的TAMs似乎表達促進腫瘤發生的基因，但它們還沒有明顯的M1和M2極化。
所有T細胞的無偏聚類在腫瘤樣本和正常組織之間沒有顯示任何不同的T細胞簇，所以作者決定檢查每個簇中T細胞亞型標記的表達。作者發現，腫瘤浸潤的T細胞高表達調節性和耗竭性標志物，如TIGIT、LAYN、FOXP3和CTLA4，而正常組織中的T細胞高表達效應性和幼稚T細胞標志物。作者還鑒定了增殖性T細胞亞型，它既表現出效應性T細胞的特征，又表現出功能障礙的標志。
拷貝數量變化CNV異常的細胞被鑒定為惡性細胞。在功能富集分析的基礎上，進一步將其劃分為8簇。這些簇分別富含低氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻譯起始、細胞周期和抗原提呈等途徑。由于腫瘤細胞同時高表達近端和遠端上皮祖細胞標志物，腫瘤細胞由不同細胞系表達譜的異質群體組成。
小編總結：
利用scRNA-seq技術(10×Genomics)，作者同時、全面地分析了腫瘤標本中不同的細胞亞群。并且鑒定了不同的腫瘤細胞亞群及其TME成分，表明LUAD在腫瘤發生的早期就已經出現了異質性。這項工作為了解亞洲患者中攜帶EGFR突變的早期LUAD患者的異質性和免疫細胞圖譜提供了有價值的資源。
四、運動關節科 · 單細胞
在運動系統中，其典型的代表之一為骨骼肌細胞，下面我將從骨骼肌細胞的角度講述在運動系統單細胞測序如何開展。在生理條件下，成人骨骼肌的細胞循環率相對較低。骨骼肌是運動、體溫和新陳代謝的重要組織。它也是哺乳動物中發現的最具再生能力的組織之一，能夠在各種創傷和病理條件下再生。雖然衛星細胞(SCs)是損傷后肌纖維再生的主要參與者，但成功的肌肉愈合需要其他細胞類型的參與，這些細胞類型直接或間接地促進了這一過程。在這種情況下，免疫細胞和纖維/成脂前體細胞在清除損傷組織的方面起著重要的作用，同時也幫助干細胞發揮其再生的作用。在過去的幾十年里，人們對肌肉再生過程中發生的復雜細胞交互進行了詳細的研究。然而，到目前為止，大多數研究主要依賴于通過少數幾個特異性標志物的表達來鑒定大量細胞群體，并分類進行體外分析。因此，由于缺乏合適的技術來解決這個問題，人們對肌肉細胞群體的異質性知之甚少。直到最近，確定單細胞轉錄組的技術的發展才得以揭示這種異質性的程度及其在肌肉生理學和病理學上的可能意義。
文獻案例：《骨骼肌再生過程中細胞群動態的高維單細胞定量分析》[4]
這篇文章發表在期刊: Cells，在最近一年的影響因子: 6.6，中科院大類: 生物學 3區
中科院小類: 3區 細胞生物學。
結果解讀：
wt：野生型模型 mdx model：肌營養不良癥小鼠模型
作者試圖確定兩種小鼠模型中不同的單個核細胞群體的特征，并監測細胞群體在再生過程中的豐度變化。在wt肌肉中，分離的單個核細胞數量在損傷后增加，在第3天達到峰值，第10天恢復到接近基線水平。相反，與組織學分析中觀察到的mdx肌肉的彈性一致，mdx小鼠受損的肌肉中沒有檢測到這種反應，在整個再生過程中，mdx小鼠的單個核細胞數量保持不變。
應用Cytofkit中t-SNE算法，對單細胞數據進行了降維處理，圖2A中14個抗原的讀數被用作t-SNE算法的輸入。這種方法產生了wt骨骼肌中單個核細胞群體抗原表達譜的二維圖，并導致識別出15個不同的細胞簇。通過將15個已識別的簇的表達譜與文獻中描述的細胞類型的表達譜進行匹配，將其進一步分組為8種細胞類型。巨噬細胞、肌源性祖細胞(MPS)、纖維/成脂前體細胞(FAP)、內皮祖細胞、外周細胞樣細胞、間充質樣細胞，剩余的三個非豐富簇的表達譜不能與已經描述的任何肌肉細胞類型匹配，因此被歸為“其他”。當作者分析不同時間點的樣品時，還可以監測CTX損傷（肌肉損傷）后細胞數量的動態變化。事實上，圖2C中的情況并不是一成不變的，因為不同細胞群體的相對豐度在再生過程中發生了變化。通過比較不同時間點的二維t-SNE圖可以更好地理解這些。在這里，用與細胞密度有關的顏色，從藍色(低密度)到紅色(高密度)，以了解再生過程中細胞群體比例的顯著變化。
在動態肌修復中，大約60%的單個核細胞暴露了CD45抗原。這個細胞隔室在受損后數量增加，在第1天和第3天達到高峰。在生理條件下，一小部分造血細胞也表達F4/80+抗原，這是一種泛巨噬細胞標志物。肌源性祖細胞(MPS)和纖維/成脂祖細胞(FAPs)未表達CD45抗原。作者的單細胞分析顯示，從第3天到第10天，兩種細胞類型的數量都翻了一倍以上。FAP群隨著再生過程的進展而變得更多，在CTX損傷后5-10天達到最大擴張，并在第20天恢復到幾乎對照組的水平，CD31簇4被認為是肌內皮細胞亞群，包含高水平表達α7整合素抗原的細胞。總體而言，內皮細胞在損傷后的最初幾天，它們的數量明顯減少，然后在再生過程接近尾聲時，超過了體內平衡水平。外周細胞樣這一群體的豐度遵循一個受再生過程控制的動力學規律，而且與經典內皮細胞的情況也非常相似。
作者進一步的目的是描述mdx營養不良肌肉對急性損傷的反應和隨后的再生過程。從mdx小鼠未損傷和ctx損傷的骨骼肌中分離單個核細胞，步驟描述的wt相同。然而，通過比較不同簇中的抗原表達譜，作者將每個簇與一種主要的肌肉單個核細胞類型相關聯，并將其與wt中觀察到的相匹配。正如在損傷后恢復的wt肌肉中觀察到的那樣，在mdx模型中，不同細胞群的相對數量在損傷后和再生過程中也發生了變化。
作為一個整體，CD45+隔室中的細胞數量在再生過程中沒有明顯變化，然而，細胞在隔室內的不同種群中的分布是高度動態的。在急性損傷前，mdx肌肉中已有大量的巨噬細胞，在wt模型中觀察到，ctx治療后早期顯著增加，在第20天恢復到mdx基線水平，約占單個核細胞總數的30%。另一方面，M2巨噬細胞在損傷后早期保持不變，直到再生過程后期才增加。雖然MAP的數量在急性損傷后的第一天就下降了，并在隨后的時間恢復到未受干擾的水平，但在整個再生過程中，FAP保持在一個恒定的高水平。內皮祖細胞的cd31表達細胞，數量首先下降了大約三倍，在再生過程的后期才恢復。這與在wt中觀察到的情況不同。外周細胞樣群也表現相似，在損傷后立即數量下降，然后緩慢恢復，但在第20天沒有達到完全恢復。
小編總結：
骨骼肌在受損時具有驚人的自我修復能力。通過應用降維技術，如t-SNE算法，作者生成了二維地圖，提供了對重建過程的可視化描述。并在單細胞水平上描述了野生型(wt)和肌營養不良(mdx)小鼠模型急性損傷后肌肉單個核細胞數量的動態。通過檢測wt或mdx小鼠注射毒素后1、3、5、10和20天的肌肉單個核細胞樣本來監測再生過程。
五、神經科 · 單細胞
神經損傷可能導致神經病理性疼痛，神經病理性疼痛嚴重影響患者的生活質量。周圍神經損傷可誘導一系列的細胞和分子反應，包括基因調控、軸突變性、衛星膠質細胞和Schwann細胞的激活、炎細胞浸潤等。損傷背根神經節基因表達譜的動態調節已被廣泛研究，并可能是神經病理性疼痛的重要觸發因素。單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種檢測單個細胞轉錄組的強大技術。scRNA-seq被應用于體感神經元的異質性檢測和背根節（DRG）神經元類型的鑒定。分析scRNA-seq數據的算法揭示了復雜生物過程中單細胞基因表達的動力學。因此，scRNA-seq可以為我們提供對神經病理性疼痛的動態進展的更深層次的洞察力。
案例解讀：《體感神經元的單細胞轉錄分析揭示神經病理性疼痛的時間發展》[5]
這篇文章發表在期刊: Cell Research，在最近一年的影響因子: 25.617，中科院大類: 生物學 1區 中科院小類: 1區 細胞生物學。
結果解讀：
作者打算確定成年小鼠在神經病理性疼痛條件下背根神經節神經元的單細胞轉錄。嚙齒類動物受到單側SNI（保留性神經損傷），可引起明顯而持久的機械性痛覺超敏。作者在SNI后6小時、24小時、2天(2天)、7天和14天的不同時間點對分離自同側L4和L5背根節的細胞進行10x Genomics scRNA-seq。DRG細胞可分為9種主要類型，具有不同的分子標記。
為了探索正常和神經病理性疼痛條件下DRG神經元的異質性，作者根據其轉錄特征對DRG神經元進行了重新分類。兩個對照樣本的神經元在t-SNE圖上均勻分布。用不同的分子標記對19個神經元簇進行了無偏鑒定。代表性基因被用來注釋這些簇。
作者使用Seurat通過10×Genomics將來自對照組和SNI組 14d的數據與使用Smart-seq2技術的數據進行集成。結果，作者確定了18個簇，在所有神經元類型中，Smart-seq2檢測到的基因數量都多于10×Genomics學檢測到的基因數量，然后，作者將18個簇與之前的報告進行了匹配，大多數簇與之前的結果是一致的。作者的數據顯示，PROKR2在~1.7%的DRG神經元中表達，而Smr2在~1.6%的DRG神經元中表達。RNAScope分析表明，Cldn9與Zcchc12在DRG神經元中沒有共表達。DCN幾乎只在神經元胞體外表達，而只有~1%的DRG神經元表達DCN。Rxfp1在~1%的DRG神經元中特異性表達，而在其他細胞中不表達。DCN和Rxfp1在DRG神經元中的表達與Zcchc12的表達一致。因此，用10×Genomics scRNA-seq鑒定了稀有的DRG神經元簇。
為了研究SNI誘導的新生神經元類型的發育和進展，作者將t-SNE圖按時間點拆分。1-16簇的神經元在各時間點均呈均勻分布。SNI之后出現了三個新的簇，命名為SNIIC1-3。SNIIC可能在SNI后很長一段時間內消失。在這三個SNI誘導的神經元簇中鑒定出數百個DEGs。用雙熒光ISH結果驗證，在SNI24h和SNI2d，ATF3和Gfra3在~5%的DRG神經元中共表達，在SNI 2d時，ATF3和Gfra3在~12%的DRG神經元中共表達。此外，SNIIC1和SNIIC3也用Gal（一種有助于軸突再生和調節神經病理性疼痛的神經肽）標記。因此，作者的數據表明SNIIC2神經元只是暫時存在的。
小編總結：
最近，10×Genomics scRNA-seq已被應用于定義神經元規范的轉錄調控，對于神經元的范疇來講，我們應該首先對處理組的目標細胞進行了10×Genomics scRNA-seq。首先，確定了與處理組密切相關的新聚類簇。然后，結合表面標志物分析新聚類簇。此外，如果我們還想加深文章的層次，還可以重建了與神經元類型相關的基因調控網絡。最后，再檢測了功能基因的表達變化，揭示了相關的分子是一個新的潛在的治療靶點。這樣一篇高分的文章就出現了~
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參考文獻
[1] D.T. Paik, S. Cho, L. Tian, H.Y. Chang, J.C. Wu, Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine, Nat Rev Cardiol, 17 (2020) 457-473.
[2] L. Wang, P. Yu, B. Zhou, J. Song, Z. Li, M. Zhang, G. Guo, Y. Wang, X. Chen, L. Han, S. Hu, Single-cell reconstruction of the adult human heart during heart failure and recovery reveals the cellular landscape underlying cardiac function, Nat Cell Biol, 22 (2020) 108-119.
[3] D. He, D. Wang, P. Lu, N. Yang, Z. Xue, X. Zhu, P. Zhang, G. Fan, Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneous tumor and immune cell populations in early-stage lung adenocarcinomas harboring EGFR mutations, Oncogene, 40 (2021) 355-368.
[4] L.L. Petrilli, F. Spada, A. Palma, A. Reggio, M. Rosina, C. Gargioli, L. Castagnoli, C. Fuoco, G. Cesareni, High-Dimensional Single-Cell Quantitative Profiling of Skeletal Muscle Cell Population Dynamics during Regeneration, Cells, 9 (2020).
[5] K. Wang, S. Wang, Y. Chen, D. Wu, X. Hu, Y. Lu, L. Wang, L. Bao, C. Li, X. Zhang, Single-cell transcriptomic analysis of somatosensory neurons uncovers temporal development of neuropathic pain, Cell Res, 31 (2021) 904-918.
