今天小編給大家介紹一篇這個月剛發在Nature communication[IF:14.913]上的文章——利用單細胞數據研究兒童神經母細胞瘤的高低風險組的細胞差異。作者的研究表明，低風險和高風險神經母細胞瘤有不同的細胞身份，代表兩種疾病實體。讓我們一起來看一下整體的研究思路吧！
Single-nuclei transcriptomes from human adrenal gland reveal distinct cellular identities of low and high-risk neuroblastoma tumors
一、研究背景：
神經母細胞瘤是一種起源于腎上腺交感細胞系的兒童癌癥。這種惡性腫瘤占兒童癌癥病例的8 - 10%，占全世界兒童腫瘤死亡病例的15%。神經母細胞瘤的臨床結局是異質性的，它可能會朝向死亡進展，但也有可能會自我消散。
年齡是神經母細胞瘤最主要的風險因素，診斷時小于18個月的小孩往往具有更好的預后。然而，為什么診斷時患者的年齡是風險和預后最有力的預測因素？這一原因目前還不清楚。此前，有報道稱，小鼠中形成腎上腺髓質的嗜鉻細胞大多數來自胚胎神經嵴后代，特別是來自多能Schwann細胞前體。
二、數據和代碼
數據：
- 不同風險組的11個不同年齡的神經母細胞瘤樣本（0-79個月）的數據
- 3個人類的健康腎上腺的數據
- 5個健康小鼠腎上腺的數據
代碼：https://github.com/oscarcbr/nc_nb_2021
三、研究結果
一)、出生后的人類和小鼠腎上腺細胞群相同，但在嗜鉻細胞上表現出差異
- 對來自三個不同患者的1536個人類腎上腺細胞、來自5個不同小鼠樣本的1920個腎上腺細胞進行了單核Smart-seq2測序，選擇高質量的細胞【人類：n = 1322；小鼠：n = 1763】。
- 用PAGODA 進一步加工。通過來自文獻的多個特定marker鑒定人類和小鼠腎上腺細胞cluster的身份。在人類中，hC4被鑒定為嗜鉻細胞簇。在小鼠中，mC11和mC15被鑒定為嗜鉻細胞(Fig.1a；1b)。
- 通過比較人類和小鼠的特異性基因標記，發現間充質細胞、內皮細胞和免疫細胞簇的轉錄標記相似，但兩種不同的嗜鉻細胞只能在小鼠中分化。其中，小鼠嗜鉻細胞群mC15與人類嗜鉻細胞群hC4共享一個更重要的特定基因marker(Fig.1c；1d)。
- 與小鼠的嗜鉻細胞相比，人類出生后嗜鉻細胞(hC4)表現出交感細胞標記物PRPH的顯著表達(Fig.2a)。
Fig.1 單核/細胞分析揭示了人類和小鼠腎上腺(AG)的解剖學
二)、人出生后腎上腺膽堿能祖細胞群的鑒定
- 作者發現了一種人類出生后腎上腺特有的細胞群(hC1)，顯著表達各種祖細胞和遷移marker。并且呈現增殖性質。利用偽時間進行的RNA速率估計表明，這類細胞群體(hC1)是嗜鉻細胞(hC4)的主要來源(Fig.1e-h)。
- 為了驗證人膽堿能祖細胞(hC1)的表達和空間背景，作者對0- 4歲兒童和成人的出生后腎上腺進行了一系列RNAscope原位雜交(Fig.2b-e)。
- 作者首先闡明了髓質(TH)、皮質(CYP11B2)和包膜(RSPO3)各部分腺體的解剖結構。為了識別屬于hC1祖細胞群的細胞，檢測了在hC1祖細胞群中顯著上調的標記:NTRK2和CLDN11(Fig.2b-d)。
- 將膽堿能煙堿受體CHRNA7(即nAChR α7)與TH和CLDN11進行了原位rna雜交。證實CLDN11+細胞具有膽堿能性質(Fig.2e)
Fig.2人膽堿能前體(NTRK2+ CLDN11+)和嗜鉻細胞(TH+)在出生后人腎上腺(AG)中的定位
三)、不同風險組的神經母細胞瘤在細胞群組成上存在差異
- 對11個不同臨床風險組和遺傳亞群的4224個人類NB細胞進行單核測序，用PAGODA將高質量的細胞(n = 3212)分成10個不同的簇(Fig.3a)。
- 不同臨床風險組和階段的神經母細胞瘤樣本包含這些簇的不同細胞貢獻，反映了這些臨床組的臨床異質性(Fig.3b)。
- 根據每一個cluster顯著上調的基因對10個亞群進行重新聚類，分析各個亞群的顯著差異的基因(Fig.3c；3d)。
- 利用基于基因富集的方法，NB的去甲腎上腺素能簇(nC5, nC7, nC8和nC9)被證實與交感去甲腎上腺素能和ADR(即腎上腺素能)轉錄特征共享大量上調基因。與此相反，未分化的聚類nC3共享了大量具有神經嵴細胞樣特征和MES(即間充質)特征的上調基因(Fig.3e)。
- 此外，每個神經母細胞瘤簇的特定基因標記與最近報道的8個GOSH 隊列腫瘤中6個細胞簇的標記進行了比較(Fig.3g)。
- 為了區分惡性和間質細胞簇，進行了基因組重排分析，并進一步實驗驗證(Fig.3h-3i)。
Fig.3兒童神經母細胞瘤的瘤內異質性
接下來，我們驗證了神經母細胞瘤簇中顯著富集的標記物的表達(Fig.4)。RNAscope原位雜交在一例MYCN擴增的神經母細胞瘤病例中，經比較基因組雜交(CGH)20獨立證實，顯示TH、MYCN和ALK表達在腫瘤內具有高度異質性，腫瘤區域MYCN和ALK染色強烈，TH陰性。其他腫瘤區域顯示少量TH+陽性、細胞核增大的細胞彌漫性染色，MYCN陽性，ALK陰性，而其他區域不顯示TH、MYCN、ALK表達。此外，我們驗證了間充質標記物PDGFRA的表達，該標記物在高危神經母細胞瘤簇中顯著高表達。
Fig.4 RNA原位雜交驗證高危神經母細胞瘤4期的瘤內異質性
四)、高危神經母細胞瘤中富集的細胞群類似于人類出生后的腎上腺祖細胞群
高危神經母細胞瘤通常發生于年齡大于18個月的兒童，通常起源于腎上腺。為了了解在高風險和低風險病例中觀察到的神經母細胞瘤群體與正常的出生后和胚胎腎上腺組織之間的關系，我們對它們的轉錄譜進行了對比分析(Fig5；6；7)。
- 在低危神經母細胞瘤病例中，腎上腺素能標記物的顯著表達在健康交感腎上腺細胞和腫瘤NOR人群中很常見（Fig.5a）。
- 與這一觀察結果一致的是，神經母細胞瘤NOR簇的特定基因標記與小鼠胚胎和人類的嗜鉻細胞和交感細胞簇以及人類和小鼠出生后的嗜鉻細胞簇顯著共享。
- 與神經母細胞瘤NOR細胞相比，未分化的神經母細胞瘤簇(nC3, nC2)與小鼠胚胎和出生后的交感細胞或嗜色細胞群體沒有共同的特定基因特征(Fig.5b-e)。
Fig.5來自神經母細胞瘤的細胞簇與出生后健康的人和小鼠腎上腺具有相同的表達特征
- 為了支持這些發現，神經母細胞瘤NOR簇在小鼠和人類發育中的腎上腺中橋細胞、交感細胞和嗜鉻細胞，以及人類出生后嗜鉻細胞中表現出較高的marker 得分。tSNE顯示了人類出生后(Fig.6a)、胚胎腎上腺(Fig.6b)和小鼠胚胎腎上腺原細胞簇(Fig.6c)的特征基因評分。
- 對498例具有低風險和高風險特征基因表達的SEQC神經母細胞瘤患者進行生存分析，KM曲線顯示，神經母細胞瘤有顯著的差異（Fig.6h）。
- 在更大的隊列中，我們進一步詳細分析了不同神經母細胞瘤簇的轉錄譜與生存率和診斷年齡之間的關系。分別比較了498例患者的風險組的差異表達（Fig.6e）、與診斷年齡顯著相關（Fig.6f）、與生存結果差異表達（Fig.6g）
- 條形圖展示了與nC9和nC3相關的特征基因與診斷時的年齡顯著相關，而與高生存率相關的特征基因則與年齡呈負相關(Fig.6h)。
Fig.6 來自神經母細胞瘤和發展中的人類和小鼠腎上腺的細胞簇具有不同的表達特征，它們的表達與患者的生存和診斷年齡相關
- 作者進一步研究了人類出生后腎上腺和神經母細胞瘤簇的共性，并基于相互最近鄰匹配檢測進行了對比分析，將來自人類腎上腺的細胞狀態投射到神經母細胞瘤數據上（Fig7.ab）。
- 此外，作者還研究了胚胎小鼠腎上腺原、神經母細胞瘤和健康人類出生后腎上腺細胞群之間的關系。對所有群體(不包括皮層和免疫細胞)的轉錄相似性進行了基于歐氏距離的分析(Fig7.cd)。該分析表明，這些細胞可以分為四組，即(1)腎上腺素能細胞，(2)未分化細胞，(3)間充質細胞和(4)內皮細胞
Fig.7 出生后和發育中的人類和小鼠腎上腺和神經母細胞瘤細胞群轉錄譜的共性
四、結果與展望
為了解神經母細胞瘤臨床異質性的轉錄基礎，作者分析了來自不同風險組的11個腫瘤患者的3212個高質量單細胞/核。并將它們與3456個人類和小鼠胚胎和出生后AG細胞進行比較。在出生后的腎上腺中，嗜鉻細胞的再生方式仍是未知的。在這項研究中，作者鑒定了一群出生后人類腎上腺特有的細胞，這些細胞具有嗜鉻細胞的前體特征，通過計算RNA速度確定了祖細胞向嗜鉻細胞轉變的方向性。RNAscope ISH驗證了它們的存在，并提示這一群體隨著年齡的增長而下降。高風險相關細胞簇(nC3)有一個轉錄程序，隨著診斷年齡的改變而改變，并與患者較低的生存幾率相關。
因此，診斷時的年齡是一個強有力的預測結果。這給我們今后的單細胞分析結合臨床特征提供了一個很好的思路——腫瘤的臨床異質性可能是在單細胞層面具有不同的細胞身份，代表不同的疾病實體。
