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2023年新鮮出爐的可變剪切科研idea, 還不碼上！
都23年了還不會可變剪切？趕緊學起來
可變剪切時隔三年又出新思路？
提起可變剪切，公眾號的粉絲們可能不會太陌生。19年的時候還給大家總結了可變剪切的一系列發文（點擊查看原文：跪了，乳頭狀甲狀腺可變剪切又發了5+），這些文章都是基于剪切百分比值（PSI）做的研究。與之前研究可變剪切思路不同，今天的思路是從兩個與可變剪切息息相關的基因家族出發 ：異質核核糖核蛋白（hnRNP）家族、富含絲氨酸/精氨酸 (SR) 剪接因子家族（鏈接到：what，幾乎所有的腫瘤研究熱點都跟它有關）。
首先給大家科普下相關知識：
可變剪接（AS）
也叫選擇性剪接，廣泛存在于真核生物細胞內，AS從共同的基因產生多種不同RNA轉錄本以及結構相似的蛋白亞型，是遺傳物質多樣化表達的代表方式。AS在腫瘤發生、發展中起重要作用。對比正常組織，腫瘤樣本存在廣泛的AS事件。異常的AS體可通過抑制凋亡、促進耐藥、促進DNA損傷修復、推進細胞周期循環等多種途徑促進腫瘤的發生發展。
異質核核糖核蛋白（hnRNP）家族
是高等真核生物中含量最豐富的核蛋白，是一類RNA結合蛋白。HnRNPA/B亞家族是hnRNPs的核心成員，與癌癥的發生和發展密切相關。研究表明HnRNPA/B在多種腫瘤中高度表達，被確定為一種有前途的癌癥生物標志物。HnRNPA/B促進腫瘤細胞的各種生物學過程，包括增殖，遷移和侵襲。
hnRNPA2/B1 在癌癥中的代表性分子機制
富含絲氨酸/精氨酸 (SR) 剪接因子家族
SRs的異常表達與腫瘤發生之間的關系主要是由于關鍵基因的可變剪接模式改變決定的。SRs的異常表達常導致上皮-間充質轉化、轉移和血管生成等癌相關過程的改變。SR蛋白在癌細胞擴增，凋亡等過程中發揮的關鍵作用。
SRs與癌癥發生發展
可變剪切新思路
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那么接下來我們就看來看研究是如何展開分析的（Journal of Translational Medicine；IF：8.440）
研究對象
急性白血病（AML）中異質核核糖核蛋白家族（hnRNPs）、富含絲氨酸/精氨酸 剪接因子家族（SRs）的32個可變剪切因子
數據隊列
訓練集：TCGA-LAML、GTEx
驗證集：GSE14468, GSE37642-GPL96, GSE37642- GPL570, GSE71014
主要結果
hnRNP和SR家族的32個可變剪切因子（SF）遺傳編譯景觀
1、大部分SFs（27）在AML和normal樣本間存在異常表達（熱圖A）
2、32個SFs呈現低的突變頻率（突變瀑布圖B）
3、32個SFs的拷貝數變異頻率展示，eg.HNRNPU拷貝數擴增表達增加（棒棒糖圖C）
4、32個SFs的染色體物理位置展示（圈圖D）
受hnRNP和SR家族的32個可變剪切因子介導的剪切調控模式
1、為了更好的識別SFs與AML生物學過程的關聯，使用SFs對AML樣本進行了無監督聚類，將AML分成了4個亞型（consensus matrix 熱圖A；驗證SFs的聚類結果t-SNE散點圖B）
2、4個不同的AML可變剪切亞型間SFs的表達差異，cluster-A的SFs表達普遍較低（熱圖C）
3、4個不同的AML可變剪切亞型間生存差異，cluster-D類預后最好，cluster-C則相反（K-M曲線圖D）
4、每個SF在AML不同可變剪切亞型間表達也呈現出顯著差異（箱線圖E）
5、4個不同的AML可變剪切亞型間的突變差異，B組的突變頻率更高現（突變瀑布圖E）
不同AML剪切調控模式的生物學特征差異
1、4個不同AML可變剪切亞型間KEGG信號通路、腫瘤相關hallmark 基因集GSVA分析，eg.cluster-A有更高的免疫反應富集,不同的剪切模式在生物學過程、免疫學特性、臨床病理因素等方面存在明顯差異（聚類熱圖A、B）
2、4個不同的AML可變剪切亞型間可變剪切事件（AS）差異，與其它亞型相比cluster-A差異的AS最多（韋恩圖C；熱圖D）
3、cluster-A可變剪切亞型AS事件主要為AP（可變啟動子）和AT（可變終止子）（upset圖E）
4、對于cluster-A中的 AS事件對應的209個基因進行了KEGG通路富集分析，主要與RNA轉運等通路相關（和弦圖F）
不同AML剪切調控模式的免疫相關特征差異及潛在用藥預測
通路富集分析表明不同剪接調控模式免疫相關通路存在顯著差異。因此，進一步分析了模式之間的免疫細胞浸潤、免疫功能活性和免疫檢查點表達差異
1、發現cluster-C富集了更多的炎性免疫細胞eg.M2巨噬細胞，CD8 + T細胞則最低（箱線圖A）
2、cluster-A呈現了更高的抗原呈遞細胞共刺激分子(APC)等免疫功能特征（箱線圖B）
3、免疫檢查點差異表達分析顯示，cluster-A中HAVCR2等表達水平顯著高于其他亞群（箱線圖C）
4、不同剪切調控模式與AML常用治療藥物的敏感性分析發現cluster-D對阿糖胞苷有更高的敏感性（箱線圖D）
5 、不同AML剪切調控模式中cluster-C對抗PD-1免疫治療更有效（submap分析熱圖D）
構建和驗證可變剪切相關的預后風險評分模型
不同可變剪切模式有不同的病理學特征和治療方式，cluster-A、B間SFs表達差異最大，cluster-C、D間預后差異最大，因此篩選了cluster-A、B 和cluster-C、D分別間的差異基因（與SFs和AML預后相關相關的基因）
1、cluster-A、B 和cluster-C、D差異基因交集，被認為是與SFs和AML預后相關相關的基因（韋恩圖A）
2、基于cox回歸篩選預后相關的因子（森林圖B）
3、Lasso回歸分析確定最終構建模型因子（lasso系數路徑圖C；lasso交叉驗證曲線D）
4、預后風險評分模型的預測效能（K-M曲線圖E；ROC曲線）
5 、單因素和多因素cox回歸確定后風險評分能作為AML的獨立預后因子（森林圖G-H）
6 、風險評分與剪切模式、生存狀態之間的關聯（沖積圖I；箱線圖J）
預后風險評分模型的驗證以及構建列線圖以預測AML的整體生存期
1、基于GEO的四個驗證隊列對可變剪切相關風險預后模型預測效能進行了獨立數據集驗證（K-M曲線圖A-D；ROC曲線圖E-H）
2、為了更準確的預測AML的OS，結合臨床病理特征構建了列車線圖（列線圖I）
3、時間依賴的校準曲線驗證列線圖的1，3，5年對AML的預測效能（校準曲線圖J）
4、列線圖和其它臨床病理特征對AML的預測效能AUC比較，列線圖最高（折線圖K）
可變剪切因子SRSF10 在AML中顯著上調并且促進了AML（實驗）
在32個SFs中SRSF12和SRSF10在AML中顯著上調。因為SRSF12是預后保護因子，因此僅對危險因子SRSF10進行深入研究，探索與 AML發生發展的關系。
1、SRSF10在AML和正常樣本間的表達差異展示（箱線圖A）
2、SRSF10在TCGA泛癌中的表達差異，在AML中表達最高，預示著SRSF10可能參與血液腫瘤發生和發展（箱線圖B）
3、PCR實驗驗證了SRSF10在AML比正常樣本中顯著高表達（柱狀圖CD）
4、構建SRSF10過表達(oeSRSF10)和敲低(shSRSF10)的轉染細胞系，PCR和WB實驗驗證SRSF10的mRNA表達和蛋白質表達水平（圖EF）
5、CCK8實驗表明與對照相比，SRSF10過表達組（SRSF10-oe）細胞的增值能力更高；并且SRSF10敲低組（SRSF10-sh1和、SRSF10-sh2）與對照組相比細胞增殖明顯減少(圖G)
6、EdU染色也顯示SRSF10-oe組細胞比對照組細胞有更多的DNA復制。然shSRSF10組DNA復制階段細胞少于對照組(圖7H，I)
7、V-FITC/PI 染色標記凋亡細胞，流式細胞術檢測發現SRSF10敲低組（SRSF10-sh1、SRSF10-sh2）細胞凋亡率均高于對照組(圖J)
8、進一步通過流式細胞術檢測了SRSF10敲低后細胞周期的變化。結果表明，與對照組相比，SRSF10敲低組（SRSF10-sh1、SRSF10-sh2）細胞在 G1期的停滯更為明顯(圖K)
小結：
這篇研究是典型的干濕結合文章，沒有大規模測序也沒有很復雜的生信分析，典型的分型+預后模型思路，中科院二區8+期刊收錄
研究內容：可變剪切相關基因家族切入+不同的可變剪切模式功能、免疫學特征+不同表型不同個性化用藥治療+預后
分析結構：分型+預后模型+實驗驗證
寫在最后：單獨依靠純生信就能輕易發文章的紅利時期已經過去了，在生信分析卷不動的時候，返璞歸真，找準新穎貼合疾病的切入點+生信分析+簡單的實驗成為科研的必經之路，畢竟生信分析也只是數據分析的手段而已，大量數據的深度學習訓練總需要落地驗證才能讓結果更可信。
可變剪切新思路
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