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用端粒酶如何發(fā)表7分+的文章
Genomic, epigenomic, and transcriptomic signatures for telomerase complex components: a pan-cancer analysis
這個(gè)是今年1月份發(fā)表在Molecular Oncology（IF：7.4）雜志上的整合轉(zhuǎn)錄組、基因組數(shù)據(jù)，研究端粒酶的文章，文章思路嚴(yán)謹(jǐn)，具有很好的參考意義。
端粒的概念誕生于二十世紀(jì)三十年代，即染色體的末端能穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和功能的特殊成分，而研究發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞復(fù)制，端粒會(huì)逐漸縮短。然而，端粒酶的作用就是延長(zhǎng)端粒，但端粒酶的活性可在多達(dá)90%的人類惡性腫瘤中檢測(cè)到。
背景
在大多數(shù)正常的人類細(xì)胞中，端粒酶是沉默的，因此端粒隨著體外細(xì)胞復(fù)制的逐漸縮短。當(dāng)端粒長(zhǎng)度失能時(shí)，DNA損傷反應(yīng)被激活，從而誘導(dǎo)正常細(xì)胞的永久生長(zhǎng)停滯或凋亡。端粒酶是一種能夠修復(fù)端粒的多單元復(fù)合物，而其核心酶僅由催化組分端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和內(nèi)部含模板的端粒酶RNA (TERC)組成，但是它的激活也往往意味著細(xì)胞惡性的開(kāi)始。
該研究也分為以下幾個(gè)階段：下載TCGA數(shù)據(jù)，端粒酶組成成分（10種基因）在泛癌中的表達(dá)情況；根據(jù)基因表達(dá)情況進(jìn)行亞組分類；不同亞組的腫瘤干性指數(shù)、侵襲性、EMT評(píng)分、基因組穩(wěn)定性、m6A甲基化情況；隨后聯(lián)合其它數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了免疫治療情況，并確定靶向端粒酶成分的藥物。研究過(guò)程中也有用自己的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)TCAB1。
結(jié)果
1.端粒酶的10種組成成分在泛癌中的表達(dá)
（1）端粒酶組成成分包括NHP2、DKC1、NOP10、TCAB1和GAR1與端粒酶核心TERT（端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶）和TERC（端粒酶 RNA 組分）穩(wěn)定相關(guān)；NVL提供ATP；
（2）分析了10種基因在33種癌癥中的相關(guān)性。
2.端粒酶的聚類分析
（1）作者使用【無(wú)監(jiān)督分類聚集分析法】根據(jù)10種基因在33種癌癥中的表達(dá)情況將分為T(mén)S-CA（高表達(dá)）、TS-CB（低表達(dá)）和TS-CC（介于兩者回見(jiàn)），構(gòu)建端粒酶（TS）評(píng)分。
（2）隨后對(duì)又分析了10 種基因在三種分類中的表達(dá)情況。
（3）三種不同亞型與預(yù)后的關(guān)系：TS-CA更好的預(yù)后，且B與C之間沒(méi)有差異（圖1F）；進(jìn)一步泛癌分析發(fā)現(xiàn)10種癌癥有更明顯的不良預(yù)后（圖1G）；最后，分析了10種基因表達(dá)與各種癌癥預(yù)后的關(guān)系（圖1G）。
圖1基于端粒酶成分表達(dá)的泛癌分層及其與患者生存的關(guān)系
3.腫瘤干性指數(shù)分析、侵襲性、EMT評(píng)分分析
目的：確定高TS組患者生存不良的表型基礎(chǔ)
（1）腫瘤干性指數(shù)
作者使用EXTEND算法計(jì)算了三個(gè)亞型的腫瘤干性指數(shù)（圖2A）；隨后又分析了所有患者該指數(shù)之間的相關(guān)性（圖2B）；最后又繪制了；33種癌癥的TS評(píng)分與腫瘤干性指數(shù)的關(guān)系（圖3C）
（2）腫瘤侵襲性評(píng)估
Ki67為特異性標(biāo)記，分析其與TS評(píng)分的關(guān)系；對(duì)所有患者進(jìn)行分析，Ki67 mRNA豐度與TS評(píng)分顯著相關(guān)（圖2D）；在每種癌癥類型的大多數(shù)隊(duì)列中，相關(guān)性仍然非常顯著（圖2E）；
（3）EMTI評(píng)分
泛癌EMT評(píng)分使用16個(gè)EMT基因標(biāo)記計(jì)算
患者層面：泛癌TS和EMT評(píng)分呈顯著正相關(guān)；
癌癥疾病層面：TS與EMT評(píng)分在15種癌癥中顯著相關(guān)，而在14種癌癥中不顯著相關(guān)。
圖2 TS亞型與腫瘤類型的干性指數(shù)、侵襲性和上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)表型的關(guān)聯(lián)
4.基于TS的亞型之間的差異生物途徑富集
作者隨后使用GSEA分析描述三種TS亞型不同表型背后的生物學(xué)和分子差異（圖3A和B），所有這些富集通路都標(biāo)志著癌細(xì)胞的高度增殖活性。
5.腫瘤基因組不穩(wěn)定性分析
（1）基因組不穩(wěn)定性
作者從以下五個(gè)層面分析了TS-CA、TS-CB、TS-CC中的腫瘤不穩(wěn)定性：TMB（腫瘤突變負(fù)荷）、SCNA（體細(xì)胞拷貝數(shù)改變）、aneuploidy（非整倍性）、LOH（雜合性丟失）、HRD（同源重組修復(fù)缺陷）。結(jié)果顯示：TS-CA亞型表現(xiàn)出最低水平的TMB、SCNA、非整倍體、LOH和HRD，而TS-CB和TS-CC亞型具有較高水平的這些改變。TS-CB與TS-CC之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。
（2）癌癥通路分析
10種致癌途徑的特異性改變，在三個(gè)TS亞型中，10條通路中有9條顯著不同，而只有TGFb通路在很大程度上相似。在包括細(xì)胞周期，Hippo, MYC, Notch, NRF2, TP53, PI3K, RTK-RAS和WNT在內(nèi)的9條通路中，促進(jìn)致癌活性而失活抑癌功能的基因組改變?cè)赥SCB和TS-CC中比在TS-CA亞型中更常見(jiàn)。（圖3D）
圖3 三種端粒酶評(píng)分(TS)亞型信號(hào)通路和基因組改變的差異
6.TS亞型間免疫細(xì)胞功能差異
作者GSEA分析顯示TS與炎癥和免疫反應(yīng)途徑之間呈負(fù)相關(guān)，想探究三種TS亞型腫瘤中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的功能是否存在差異。
（1）腫瘤免疫功能障礙和排除(TIDE)評(píng)分
TIDE算法是用來(lái)預(yù)測(cè)不同癌癥類型的免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)應(yīng)答的工具。TSCB亞型具有最高的髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)和M2巨噬細(xì)胞(M2)評(píng)分，而最低的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)評(píng)分（圖4A）。
（2）使用歐洲基因組-表型組檔案（European Genome-phenome Archive，EGA）的患者進(jìn)行驗(yàn)證
從EGA數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇接受尼伏單抗或依維莫司治療腎透明細(xì)胞癌患者轉(zhuǎn)錄組與臨床數(shù)據(jù)，計(jì)算每位患者的TS值，單抗根據(jù)腫瘤中位TS值將患者分為高TS組和低TS組。尼伏單抗（Nivolumab，PD-1抑制劑）患者中，低TS組患者OS和PFS明顯較長(zhǎng)（圖4B）。其余130例接受MTOR抑制劑依維莫司治療的患者進(jìn)行同樣分析，但結(jié)果提示TS評(píng)分既不與OS相關(guān)也不與PFS相關(guān)。
圖4 端粒酶評(píng)分(TSs)與癌癥免疫逃逸的關(guān)系
7.拷貝數(shù)變異（Copy number variation, CNV）
（1）在10個(gè)端粒酶組分中，TERC拷貝數(shù)增加最多，且以其擴(kuò)增為主，純合缺失非常少見(jiàn)（圖5A和B）；
（2）基于33種癌癥類型的非同義突變狀態(tài)，我們進(jìn)一步分析了10種端粒酶組分的體細(xì)胞突變；總突變頻率為4.5%(464/10245個(gè)腫瘤)，主要發(fā)生在TERT、NVL、RUVBL2、TCAB1, DKC1和RUVBL1（圖5C）；
（3）突變似乎是隨機(jī)的，至少對(duì)于TERT和DKC1來(lái)說(shuō)，在損害它們功能的已知位點(diǎn)上沒(méi)有發(fā)生突變（圖5D）；
（4）端粒酶成分突變和cna在UCEC中均常見(jiàn)，而cna在LUSC和PRAD中更常見(jiàn);然而，肺鱗狀細(xì)胞癌和PRAD分別表現(xiàn)出廣泛的擴(kuò)增和缺失（圖5D-F）。
圖5癌癥類型中10種端粒酶組分的基因組改變
8.TCAB1基因純合缺失的腫瘤細(xì)胞端粒酶活性
分析目的：TCBA1之前被證明是端粒酶運(yùn)輸、組裝和功能所必需的，但是在癌癥中經(jīng)常發(fā)生純合性缺失。
作者在CCLE數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步分析并發(fā)現(xiàn)：40%的血癌源性細(xì)胞系存在純合子TCAB1缺失，這些細(xì)胞系中TCAB1表達(dá)顯著降低，使用EXTEND算法分析發(fā)現(xiàn)TCAB1缺失和無(wú)TCAB1缺失的細(xì)胞系之間沒(méi)有差異。
進(jìn)一步評(píng)估了原發(fā)泛癌樣本的端粒酶活性，將其分為T(mén)CAB1基因heterozygous deletion（雜合缺失）, homozygous deletion（純合缺失）, no deletion（未缺失），結(jié)果顯示在大多數(shù)癌癥類型(21/33)中，三組之間的酶活性無(wú)差異。在端粒酶活性有顯著差異的12種癌癥類型中，雖然TCAB1的純合和雜合缺失導(dǎo)致基因表達(dá)顯著降低(圖6B 頂)，但EXTEND評(píng)分最高更容易出現(xiàn)在雜合缺失組中(圖6B 底)。
后續(xù)又測(cè)定了來(lái)自血液系統(tǒng)惡性腫瘤(3個(gè)髓系和3個(gè)淋巴系)的6個(gè)細(xì)胞系的端粒酶活性。HL60、KG1和LP1細(xì)胞攜帶TCAB1純合缺失，其余3種細(xì)胞系未發(fā)生TCAB1缺失。
（實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）
TCAB1純合缺失和無(wú)TCAB1純合缺失的細(xì)胞端粒酶活性。分別采用免疫印跡法(左上)和端粒酶PCR ELISA試劑盒(左下)對(duì)6株血液癌細(xì)胞的TCAB1和端粒酶活性進(jìn)行了直接分析。進(jìn)行了三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示TCAB1缺失細(xì)胞的TCAB1蛋白表達(dá)水平明顯降低，但與未缺失TCAB1拷貝的細(xì)胞相比，其端粒酶活性并未降低甚至升高。（圖6C）
圖6 純合子TCAB1缺失對(duì)癌細(xì)胞和原發(fā)腫瘤端粒酶活性無(wú)影響
9.端粒酶組分的DNA甲基化和m6A調(diào)控
除TGCT、DLBC和THYM外，TCAB1在幾乎所有類型的腫瘤中均呈負(fù)相關(guān)。在大多數(shù)癌癥類型中，DKC1、RUVBL1、NHP2和TERC的表達(dá)也與DNA甲基化呈負(fù)相關(guān)。
對(duì)m6A調(diào)控劑和TS評(píng)分的分析
TS評(píng)分與mettll3呈正相關(guān)，而與METTL14呈負(fù)相關(guān)(圖7B)。m6a招募了結(jié)合蛋白YTHDC1，YTHDC2、YTHDF3和FMR1呈負(fù)相關(guān)，HNRNPC、HNRNPA2B1、YTHDF1和FMR1呈負(fù)相關(guān)在大多數(shù)癌癥類型中，RBMX與TSs呈正相關(guān)。
圖7 端粒酶組分表達(dá)與m6A調(diào)控因子和DNA甲基化的關(guān)系。
10.靶向端粒酶成分的藥物
在CMap（Connectivity Map）數(shù)據(jù)庫(kù)中，作者發(fā)現(xiàn)23種藥物與TSs呈負(fù)相關(guān)33種癌癥類型中≥15種。Bromodomain抑制劑，尤其是BRD4抑制劑，表現(xiàn)出最廣泛的活性（圖8）。
圖8 抑制TS的癌癥治療藥物
11.在有端粒選擇性延長(zhǎng)(ALT)激活或沒(méi)有端粒維持的腫瘤中的TS評(píng)分情況
作者將腫瘤細(xì)胞分為ALT陽(yáng)性腫瘤、TERT陽(yáng)性腫瘤和雙陰性（TERT-/ALT-）腫瘤分類了ALT腫瘤。圖9A顯示了33種癌癥類型中3種不同腫瘤的分布。雙陰性腫瘤的TSs最低，而TERT+腫瘤的腫瘤最高，雙陰性腫瘤與TERT+腫瘤或ALT+腫瘤之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖9B）。TERT+腫瘤中TS評(píng)分高于ALT+腫瘤，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖9B）。桑基圖進(jìn)一步顯示了這些腫瘤和TS亞型之間的關(guān)系：TS-CB和CC亞型主要來(lái)自TERT+腫瘤，TS-CA來(lái)自TERT+和雙陰性腫瘤，而ALT+腫瘤均勻分布在三個(gè)TS亞型（圖9C）。
圖9 端粒酶評(píng)分（TS）與33種癌癥類型的TERT+、替代端粒延長(zhǎng)（ALT）+和TERT-/ALT-腫瘤的相關(guān)性
討論
本文以端粒酶的組成成為線索，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)一步一步探索他們?cè)诜喊┲械谋磉_(dá)情況并構(gòu)建亞型與端粒酶評(píng)分，隨后又分析了不同亞型以及評(píng)分與腫瘤干性指數(shù)、腫瘤侵襲性、EMT的關(guān)系，緊接著分析了亞型通路富集情況、免疫逃逸情況。在免疫逃逸情況方面，作者并用其它數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)免疫情況進(jìn)行并在數(shù)據(jù)庫(kù)中確定了靶向藥物。整篇文章思路嚴(yán)謹(jǐn)，環(huán)環(huán)相扣，很值得學(xué)習(xí)。
參考文獻(xiàn)
Wang J, Dai M, Xing X, Wang X, Qin X, Huang T, Fang Z, Fan Y, Xu D. Genomic, epigenomic, and transcriptomic signatures for telomerase complex components: a pan-cancer analysis. Mol Oncol. 2023 Jan;17(1):150-172. doi: 10.1002/1878-0261.13324. Epub 2022 Oct 31. PMID: 36239411; PMCID: PMC9812836.
