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大家好，今天給大家來聊聊“時空組學”那些事兒。2021年1月，時空組學被Nature Methods雜志列為2020年度技術，時空組學的出現被認為能帶來生命科學領域第三次科技革命。今天給大家分享的文獻是2022年1月份發表在Cancer Discovery（IF=39.39）上的一篇關于結直腸癌肝轉移的時空組學文章。

Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level

結直腸癌肝轉移的單細胞時空免疫圖譜

摘要：肝轉移是結直腸癌死亡的主要原因，表現出高度異質性和抑制性的免疫微環境。本文通過使用單細胞RNA測序和空間轉錄組學測定了97個配對樣本。值得注意的是，轉移性微環境對免疫抑制細胞（如MRC1⁺ CCL18⁺ M2樣巨噬細胞）進行了顯著的空間重編程。作者進一步開發了單細胞代謝組學，一種用于量化單細胞代謝的計算方法，并觀察到這些巨噬細胞具有很強的代謝活性。有趣的是，新輔助化療可以阻斷這種狀態并恢復有反應患者的抗腫瘤免疫平衡，而無反應患者則惡化為更具抑制性的患者。本文描述了轉移的免疫進化，并揭示了腫瘤如何對新輔助化療作出反應的黑匣子。

背景：

肝轉移仍然是阻礙結直腸癌患者長期生存的主要原因，這也在一定程度上解釋癌細胞高度動態的傳播路徑。在癌細胞中，肝轉移的腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）具有高度免疫抑制表型，誘導抗原特異性T淋巴細胞系統性損失，并驅動腫瘤擴散。目前仍不清楚免疫細胞是如何在空間上影響結直腸癌肝轉移（colorectal cancer liver metastasis, CRLM）的進展和轉移。因此，迫切需要記錄、識別和量化CRLM的細胞甚至空間景觀，以刷新對轉移生物學的認識。

新輔助化療（Neoadjuvant chemotherapy, NAC）是指在腫瘤手術切除前使用化學藥物。在CRLM中，NAC有明顯出乎意料的結果。在一些報道中，NAC被證明可以延長無進展生存期和總生存期。然而，特別是在低風險可切除的CRLM患者中，NAC與總體生存期未改善相關。另一個獨立研究報道NAC不能延長無病間隔時間。這些看似矛盾的數據提出了一個關鍵但尚未被充分理解的問題，即NAC是否有助于CRLM患者的抗腫瘤反應和改善預后。因此，準確剖析NAC的作用，特別是TME的改變，對于理解NAC的關鍵機制和設計新的治療策略是至關重要的。

在這里，作者使用來自24例患者的97個樣本的單細胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉錄組學（spatial transcriptomics, ST），目的是探索CRLM的免疫圖譜。作者發現：免疫微環境數據顯示了從原發到轉移部位的動態細胞和空間變化。NAC治療后，反應性患者的免疫表型進行了抗腫瘤重塑，而非反應性患者的免疫表型則轉向了更多的免疫抑制，免疫抑制細胞在轉移位點被重新編程。作者的研究結果強調了高效NAC治療可切除CRLM患者的良好效果，并允許數據驅動的新型治療組合設計，例如在選定患者中采用NAC加免疫治療。

方法：

1.樣本：復旦大學中山醫院結直腸癌肝轉移樣本。20名患者的89份樣本進行sc-RNA，4名患者的8份樣本進行空間轉錄組測序，27例患者的104份樣本進行多重IHC（mIHC）分析。

2.scRNA-seq：10x Genomics，NovaSeq。

3.空間轉錄組：10x Genomics，ST測序。

結果：

1.整合scRNA-seq和空間轉錄組精確量化可切除結直腸癌肝轉移樣本的免疫細胞多樣性

為了定義結直腸癌肝轉移樣本的單細胞圖譜，作者使用結直腸癌、鄰近結腸、肝轉移和鄰近肝臟、結腸淋巴結和外周血單個核細胞（PBMC）的配對樣本，應用scRNA-seq和空間轉錄組來量化CD45⁺細胞動力學（圖1A）。20名患者的89份樣本進行了scRNA-seq，4名患者的8份樣本進行了空間轉錄組測序，其中13名患者的54份樣本未接受治療，6名患者的30份樣本接受了部分緩解（partial response, PR）的新輔助化療，來自5名患者的13份樣本接受了疾病進展或疾病穩定（progressive disease or stable disease, PD/SD）（圖1A）的新輔助化療。所有腫瘤都是微衛星穩定型。

作者從結直腸癌肝轉移樣本中鑒定出骨髓細胞、CD8⁺ T細胞、CD4⁺ T細胞、NK細胞和B細胞（圖1B、C）。值得注意的是，不同組織類型的T細胞比例明顯不同，表明免疫微環境的組織異質性（圖1D）。結直腸癌和配對肝轉移均表現出調節性T細胞（Treg）約為10%，然而這種細胞在鄰近的正常組織中是少見的，這表明存在被抑制的腫瘤內免疫，以前被認為是肝轉移免疫治療效果降低。同樣作者整合了SingleR和基于手工標記的注釋來進一步定義免疫細胞亞群（圖1E）。同時，分析了來自兩名未治療患者和兩名新輔助化療部分反應（NAC-PR）患者（圖1F、G）的8個樣本（配對結直腸癌和肝轉移）的空間轉錄組數據。無監督聚類分析將樣品分類為不同的區域，例如腫瘤和成纖維細胞區域（圖1F）。在未經處理的樣本中，作者觀察到與scRNA-seq一致的免疫細胞模式，例如CD8⁺ T細胞在肝轉移和結直腸癌中顯著富集（圖1G）。相比之下，在新輔助化療（NAC）處理的樣本中，觀察到較小的腫瘤區域和免疫細胞的不規則分布。特別是在肝轉移中，只有一小部分斑點聚集成癌細胞，表明新輔助化療治療后細胞區室發生了根本性的重塑。總之，這些結果突出了結直腸癌肝轉移患者的時空動態免疫細胞景觀和新輔助化療后的巨大重塑。

圖1 scRNA-seq和空間轉錄組揭示了結直腸癌肝轉移樣本的免疫圖譜

2.轉移性腫瘤富含免疫抑制細胞，尤其是MRC1⁺ CCL18⁺ M2樣巨噬細胞

考慮到患者的異質性細胞組成，作者使用算法來估計細胞比例，作者過濾了低豐度的免疫細胞，聚集免疫細胞群，并將其縮放在組織中（圖2A）。一些免疫抑制細胞特異性地存在于肝轉移中，其中觀察到SPP1⁺巨噬細胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞急劇增加（圖2B）。中性粒細胞作為潛在的促瘤參與者也在肝轉移中富集（圖2B）。同樣，MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞和SPP1⁺巨噬細胞在未經治療的肝轉移中富集（圖2C）。這些數據與scRNA-seq數據一致，進一步證實了肝轉移中潛在的抑制性TME。接下來試圖在另外三個獨立的結直腸癌肝轉移人群中驗證這一發現。首先，作者使用mIHC來量化同一醫院另外27名結直腸癌肝轉移患者中選定免疫細胞亞群的空間分布（圖2D-F）。在未處理的樣本中，作者觀察到FOXP3⁺ Tregs、MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞和SPP1⁺巨噬細胞在結直腸癌和肝轉移中浸潤顯著增加，這與scRNA-seq數據基本一致（圖2F）。作者探討了TCGA中結直腸癌人群中scRNA-seq定義的免疫細胞亞群的預后價值，發現原發性腫瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞和SPP1⁺巨噬細胞的高分都預示著預后更差（圖2G）。這些結果還使作者假設：特定的巨噬細胞亞群可能在結直腸癌肝轉移前腫瘤生態位形成中起根本作用。

圖2 從原發腫瘤到肝轉移的免疫重塑，尤其是MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞

3.轉移性腫瘤的巨噬細胞可能受到抑制

鑒于肝轉移中巨噬細胞亞群的富集，作者假設這些肝轉移富集的巨噬細胞在不同組織中可能在功能上是不同的。因此，作者進行了基于配體-受體的腫瘤-免疫交叉分析，并比較了原發部位和轉移部位（圖3A），引人注目的是，SPP1⁺巨噬細胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞在肝轉移和結直腸癌之間的所有差異交叉細胞類型中排名靠前。該結果表明肝轉移癌細胞可能優先重編程巨噬細胞并誘導其特定的功能狀態（圖3A）。值得注意的是，肝轉移中的轉移性腫瘤細胞優先表達配體CD47，因此可能會通過相應的受體SIRPA募集或激活MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞（圖3B）。作者進一步利用mIHC來可視化這些蛋白質并直接觀察CD47⁺腫瘤細胞和SIRPA⁺巨噬細胞之間的交叉（圖3C）。這些特異性富集于肝轉移的配體-受體對為靶向治療肝轉移提供了線索。

為了確定獨特的TME差異，作者在結直腸癌和肝轉移巨噬細胞之間進行了差異基因表達分析。值得注意的是，肝轉移富集的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞高度表達巨噬細胞極化的關鍵分子（圖3D）。APOE作為一種抗炎和前M2轉換蛋白，是顯著差異表達的基因之一。其他M2極化相關基因如MARCO在肝轉移富集的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞中也顯著上調（圖3E）。相比之下，作者發現富含結直腸癌的MRC1⁺CCL18⁺巨噬細胞表現出更高的炎性細胞因子，包括TNF、IL1B、CCL3和CCL4。在SPP1⁺巨噬細胞中也觀察到這種分子譜的變化，表明巨噬細胞具有從原發性到轉移性的共同功能變化。通路富集分析顯示（圖3F）來自結直腸癌和肝轉移的MRC1⁺ CCL18巨噬細胞代謝途徑明顯富集，這也突出了代謝在確定這些巨噬細胞功能中的基本作用。值得注意的是，作者發現結直腸癌中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞富含氧化磷酸化，而它們在肝轉移中的對應物則以氨基酸代謝為主。這些數據強調了代謝調節可能介導巨噬細胞響應不同的微環境表型和功能轉變。

圖3 轉移性腫瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞表現為終末分化和抑制狀態

4.MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞在肝轉移中的代謝活性急劇增加

在單細胞分辨率下挖掘代謝活動仍具有挑戰性，主要是因為缺乏易于使用的計算方法。作者在本文中提出了單細胞代謝R包，它由三個連續步驟組成（圖4A）。為了了解結直腸癌肝轉移中骨髓細胞的代謝情況，作者首先計算了抑制性巨噬細胞和單核細胞所有76種活躍代謝途徑的評分。其中，作者選擇前50%的可變代謝評分，并根據其平均代謝評分對骨髓細胞進行排序（圖4B）。引人注意的是，肝轉移-浸潤性的MRC1+ CCL18+巨噬細胞在所有骨髓細胞中表現出最高的代謝活性，表明它們非常有活力，這可能與其在轉移部位的獨特功能有關。MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞的所有代謝相關基因無監督聚類觀察到與周圍組織相關的強代謝偏好（圖4C），確定了在結直腸癌和肝轉移中可能上調的42種代謝途徑-浸潤的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞。隨后仔細研究差異表達代謝基因，并發現在原發性和轉移性浸潤的MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞中特異性上調的代謝基因，部分是已知藥物的靶基因（圖4C）。GSTO1是一種通過細胞色素P450代謝異生物質的酶，在結直腸癌和肝轉移樣本中浸潤MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞中顯著升高，并與分化相關。IL4I1和MIF是巨噬細胞活化所必需的基因，也顯示出相似特征（圖4D、E）。接下來為了確定巨噬細胞的這種高度代謝激活狀態是否在物種間是保守的，作者構建結直腸癌肝轉移的小鼠模型（圖4G）。結果，在小鼠結直腸癌肝轉移模型中發現了類似的巨噬細胞亞群，例如MRC1⁺巨噬細胞和Spp1⁺巨噬細胞（圖4H）。進一步代謝量化顯示富含肝轉移和結直腸癌浸潤巨噬細胞的特征代謝狀態（圖4I）。為了說明代謝重編程與巨噬細胞表型變化的關聯，作者計算了巨噬細胞的經典表型評分，例如抗原加工和呈遞、炎癥、血管生成、免疫抑制、吞噬作用、白細胞介素信號通路和補體。事實上，在肝轉移中，MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞的抗原加工呈遞和補體活性得分顯著增加（圖4J）。有趣的是，幾種巨噬細胞特異性代謝途徑，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化，在肝轉移中顯示出與抗原加工呈遞的強相關性，但在結直腸癌中表現出弱相關性（圖4K）。這些數據共同暗示了在決定MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞表型上潛在的代謝作用。

圖4 轉移性腫瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞表現出較高的代謝活性

5.新輔助化療-響應和非響應腫瘤擁有不同的免疫動力學，尤其是在宏觀上

為了探討NAC對抗腫瘤免疫的影響，作者對所有CD45⁺細胞進行聚類分析。有趣的是，作者觀察到在結直腸癌和肝轉移之間細胞聚集的明顯不同（圖5A）。為了了解哪種類型的細胞改變，作者計算了細胞成分并做了差異分析（圖5B、C）。值得注意的是，新輔助化療對TME的影響呈現高度細胞類型特異性和相互關聯性（圖5B、C）。在部分反應的腫瘤中，新輔助化療能下調免疫抑制性細胞和細胞毒性細胞（圖5B）。在肝轉移中，響應性新輔助化療下調SPP1+巨噬細胞但上調細胞毒性T細胞（如GZMK⁺ CD8⁺ T細胞、XCL1⁺ CD8⁺ T細胞）（圖5B、D）。在肝轉移中SPP1⁺巨噬細胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞浸潤增加，而細胞毒性免疫細胞（FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T細胞）浸潤下降（圖5C、E、F）。總之結果表明，有效的新輔助化療不僅能重新編程腫瘤內免疫平衡，還能激活全身抗腫瘤免疫反應，為新輔助化療在可切除結直腸癌肝轉移中的潛在應用提供了證據。

圖5 新輔助化療通過激活細胞毒性免疫細胞和抑制轉移性腫瘤的免疫抑制細胞來恢復免疫平衡

6.在反應性腫瘤中新輔助化療誘導巨噬細胞代謝重編程

考慮到新輔助化療主要影響髓系群尤其是巨噬細胞，因此作者想探究巨噬細胞的軌跡是否被新輔助化療重編程。作者把骨髓細胞根據新輔助化療治療反應確定了髓系細胞分布，并確定了PD/SD和PR樣本之間的髓系表型豐富性。在未處理樣本中，作者觀察到髓樣細胞的發育軌跡，而PR組髓樣細胞富含單核細胞表型，表明其早期分化狀態（圖6A）。細胞比例差異分析證實了在NAC-PR腫瘤中巨噬細胞的終末狀態缺失，如MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞和SPP1⁺巨噬細胞顯著下調（圖6B）。相比之下，與未接受治療的腫瘤相比，NAC-PD/SD腫瘤中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞和SPP1⁺巨噬細胞水平顯著升高（圖6B）。接下來，作者利用mIHC在另一些人群中檢查這些巨噬細胞（圖6C），證實MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞浸潤和SPP1⁺巨噬細胞在NAC-PR肝轉移中浸潤較少（圖6D）。軌跡推斷分析進一步明確了S100A9⁺單核細胞向MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞的發育軌跡，表明未治療組與NAC-PR組的極化相反（圖6E）。結果表明，化療阻斷巨噬細胞的軌跡只存在于反應性腫瘤中。

鑒于轉移性腫瘤中MRC1⁺ CCL18⁺和SPP1⁺巨噬細胞數量有限，作者對未處理和新輔助化療處理的樣本中所有髓系細胞進行了通路富集分析，發現在PR和PD/SD組中新輔助化療誘導髓系細胞特異性功能改變（圖6F）。PR組肝轉移巨噬細胞表現出核糖體富集的基因特征，而PD/SD組與補體和凝血級聯相關。單細胞代謝途徑分析表明新輔助化療顯著阻斷髓系代謝，PR組代謝顯著下調（圖6G）。總之，新輔助化療可引起髓系特異性代謝重編程，這可能有助于大家對新輔助化療誘導的抗腫瘤機制的理解，并為可切除的結直腸癌肝轉移患者提供潛在的治療方法。

圖6 新輔助化療治療樣本中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞的代謝重編程

7.多轉移灶免疫微環境呈高度多樣化

為了特異性捕獲轉移間免疫異質性，作者對4例肝轉移多轉移灶患者的所有CD45⁺細胞進行無監督聚類。有趣的是，多轉移灶表現出明顯不同的免疫圖譜（圖7A）。對于未治療的患者（P10），肝轉移位點2在相鄰肝臟的同一簇中，而肝轉移位點1與其他樣本不相似。另外3例新輔助化療的多灶性肝轉移酶也具有轉移間異質的免疫特征。未治療組和肝轉移位點中細胞成分中的免疫抑制性細胞浸潤明顯有差異，而肝轉移患者P10中MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞浸潤有顯著差異（圖7B）。如此顯著的轉移間異質性可能導致對化療和其他治療的不同反應，這在臨床實踐中得到了充分證明。

圖7 多發轉移灶的異質性免疫微環境

結論：

作者提出了結直腸肝轉移的單細胞空間圖譜，并在轉移部位發現了高度代謝激活的 MRC1⁺ CCL18⁺ M2樣巨噬細胞，有效的新輔助化療可以減緩這種代謝激活，提高靶向轉移代謝途徑的可能性。

參考文獻：Wu Y, Yang S, Ma J, et al. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level[J]. Cancer Discov, 2022, 12 (1):134-153. DOI:10.1158/2159-8290.CD-21-0316.