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大家好呀~今天要給大家分享的是2022 年 5 月發(fā)表于《Frontiers in Immunology》（IF：7.561）上的一篇文獻(xiàn)。話不多說，一起來看看吧~
與免疫浸潤和結(jié)腸癌治療反應(yīng)相關(guān)的預(yù)后程序性細(xì)胞死亡相關(guān)lncRNA 的特征
程序性細(xì)胞死亡 (PCD) 是多種生理環(huán)境中必不可少的生物過程，包括胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)的維持和宿主對(duì)病原體的免疫防御。細(xì)胞凋亡是PCD的傳統(tǒng)模式，主要由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在途徑和涉及死亡受體的外在途徑組成。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是由炎性小體引發(fā)的一種細(xì)胞程序性死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放進(jìn)而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡是自然免疫反應(yīng)的重要組成部分，在對(duì)抗感染和惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。鐵死亡是一種鐵依賴的細(xì)胞死亡，其特征是細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累。這一過程依賴于腫瘤微環(huán)境中損傷相關(guān)分子模式的釋放和由鐵死亡細(xì)胞損傷引發(fā)的免疫反應(yīng)。調(diào)控鐵死亡可以抑制多種癌癥的細(xì)胞遷移、侵襲和增殖。
簡要概括版
篩選具有預(yù)后價(jià)值的PCD 相關(guān) lncRNA構(gòu)建預(yù)后模型并加以驗(yàn)證，最后挑選出特定的重要基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
詳細(xì)介紹版
研究人員首先在TCGA中下載結(jié)腸癌患者的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息，并利用GENCODE 數(shù)據(jù)庫中的 lncRNA 注釋文件進(jìn)行注釋，基于相關(guān)系數(shù) > 0.3 和 p < 0.05 的 Spearman 相關(guān)分析篩選 TCGA-結(jié)腸腺癌 (COAD) 數(shù)據(jù)中的 PCD 相關(guān) lncRNA，根據(jù)聚類分析結(jié)果將患者分組。然后使用單因素Cox 回歸分析篩選具有預(yù)后價(jià)值的 lncRNA，篩選出八個(gè)與 PCD 相關(guān)的 lncRNA 用于構(gòu)建預(yù)后模型，利用公共數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)對(duì)該模型的準(zhǔn)確性和有效性進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)高危組和低危組患者的表觀遺傳修飾和免疫細(xì)胞浸潤變化進(jìn)行探究。最后通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 lncRNA U62317.4 的致癌作用。
1. 基于 PCD 相關(guān) lncRNA識(shí)別預(yù)后不同的結(jié)腸癌患者分組
根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)，共有199 個(gè)與 PCD 相關(guān)的基因：33個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，52 個(gè)與細(xì)胞焦亡相關(guān)以及 114與鐵死亡相關(guān)。圖 2A-C結(jié)果顯示，大多數(shù) PCD 相關(guān)基因的表達(dá)在結(jié)腸癌和正常組織之間存在顯著差異。研究人員通過相關(guān)性分析篩選出與這些基因表達(dá)最密切相關(guān)的 lncRNA，在 437 個(gè) PCD 相關(guān) lncRNA 中，與細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡和鐵死亡相關(guān)的lncRNA分別是85、161 和 297 個(gè)（圖 2D-F）。利用單變量 Cox 分析篩選出41 個(gè) PCD 預(yù)后相關(guān)的 lncRNA（圖3A、B）。圖 3C差異分析顯示，這些 lncRNA 的表達(dá)在腫瘤和正常組織之間存在顯著差異。結(jié)合共識(shí)矩陣?yán)鄯e分布函數(shù)曲線和 delta 面積圖，研究人員選取K = 2并基于上述 lncRNA 的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌樣本進(jìn)行共識(shí)聚類分析。KM生存曲線顯示，cluster 1 的 OS 率顯著優(yōu)于cluster 2（圖 3D-G）。在臨床特征上，cluster 1 中的T 分期、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等級(jí)更高（圖3H）。
2. 結(jié)腸癌亞群的生物學(xué)功能分析
為進(jìn)一步探究不同亞群之間預(yù)后差異的內(nèi)在原因，研究人員對(duì)不同亞群中的 DEGs進(jìn)行GSEA、GO 和 KEGG 分析。GSEA結(jié)果顯示，免疫相關(guān)B細(xì)胞受體、趨化因子、JAK-STAT、T 細(xì)胞受體和 Toll 樣受體信號(hào)通路在cluster 1 中異常激活（圖 4A）。與 GSEA 結(jié)果一致，GO 結(jié)果顯示DEG 參與免疫相關(guān)功能（圖 4B-D）。圖 4E中KEGG 分析顯示，DEGs主要與信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞生長、趨化因子、細(xì)胞因子和吞噬體相關(guān)。
3. cluster 1 和cluster 2腫瘤免疫微環(huán)境和免疫檢查點(diǎn)分析
上述分析顯示，不同亞群之間的DEGs主要與免疫相關(guān)功能有關(guān)，于是研究人員進(jìn)一步對(duì)結(jié)腸癌免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞分布進(jìn)行分析。圖 5A結(jié)果顯示，cluster 1 和cluster 2的免疫細(xì)胞浸潤量顯著不同。cluster 1中的記憶 CD4 T 細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量豐富，而cluster 2中有更多的濾泡輔助 T 細(xì)胞和靜息自然殺傷 (NK) 細(xì)胞（圖 5B-E）。圖 5F-H結(jié)果顯示，cluster 2的免疫、基質(zhì)和ESTIMAT分?jǐn)?shù)顯著低于cluster 1。圖 5I中的結(jié)果顯示cluster 2中的免疫功能完全受到抑制?？紤]到免疫檢查點(diǎn)在免疫治療中的重要性，研究人員又對(duì)兩個(gè)亞群中免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除TNF受體超家族成員 (TNFRSF) 25 和 14 之外的所有免疫檢查點(diǎn)基因在cluster 2 中均受到顯著抑制（圖 5J）。因此，研究人員推測(cè)該亞群中患者的較低 OS 率可能是由于免疫功能受到抑制。
4. 構(gòu)建PCD 相關(guān) lncRNA 預(yù)后模型
研究人員篩選出八個(gè)基因（AC004080.1, AC078923.1, AC114730.3, AC156455.1，LINC01419, LINC00997, NKILA和U62317.4）用于構(gòu)建預(yù)后模型，并根據(jù)這八個(gè)基因的回歸系數(shù)和表達(dá)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖 6A-C）。為測(cè)試模型的準(zhǔn)確性和有效性，研究人員將患者隨機(jī)分為訓(xùn)練組（N = 260）和測(cè)試組（N = 176），然后根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將其分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。生存分析結(jié)果顯示，訓(xùn)練組高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的 OS 比低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者更差（圖 6D），高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的死亡率顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者（圖 6G）。圖 6J 中ROC 曲線顯示，預(yù)后模型可準(zhǔn)確預(yù)測(cè) CC 患者的 1、3 和 5 年生存率。該模型的準(zhǔn)確性在測(cè)試組（圖 6E、H、K）和整個(gè) TCGA 數(shù)據(jù)集（圖 6F、I、L）中也得到了驗(yàn)證。
5. 預(yù)后模型的獨(dú)立因素和臨床病理學(xué)相關(guān)性分析
接下來，研究人員通過單因素和多因素Cox 分析進(jìn)一步證實(shí)預(yù)后模型的獨(dú)立性。圖 7A和B 結(jié)果顯示年齡和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是結(jié)腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。圖 7C結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組中所有八種 PCD 相關(guān) lncRNA 的表達(dá)顯著增加。隨后，研究人員構(gòu)建了一個(gè)列線圖，其中包括患者年齡、性別、腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以準(zhǔn)確量化生存率（圖 7D）。校準(zhǔn)曲線、ROC 曲線下面積和DCA 決策曲線結(jié)果顯示該列線圖可有效評(píng)估患者的預(yù)后（圖7E-L）。
6. 高危和低危人群的功能富集和免疫細(xì)胞浸潤水平分析
圖 8A 為基于 TIMNER、CIBERSORT、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL 和 EPIC 算法的免疫浸潤熱圖。免疫功能差異分析顯示，Apcin (APC)協(xié)同抑制、 APC 協(xié)同刺激、檢查點(diǎn)、細(xì)胞溶解活性、促炎作用、 MHC I 類、 t 細(xì)胞協(xié)同抑制和 t 細(xì)胞協(xié)同刺激在高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異顯著。說明八種 PCD 相關(guān) lncRNA 預(yù)后特征與免疫細(xì)胞浸潤具有相關(guān)性。
7. 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 TMB 和基因 CNVs 的相關(guān)性
圖 8C 結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的 TMB 水平低于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者。進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 TMB 呈負(fù)相關(guān)（圖 8D）。然后研究人員根據(jù)中位 TMB 將患者分為 TMB 高、低兩組。生存分析結(jié)果顯示，高 TMB 患者的 OS 率顯著低于低 TMB 患者（圖 8E）。此外，研究人員還評(píng)估了高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組的體細(xì)胞突變情況，瀑布圖顯示的是突變頻率最高的前 20 個(gè)基因（圖 8G、H）。高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間差異最大的前 40 個(gè)基因的 CNVs 分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的 DEGs 中 CNVs 突變頻率更高（圖 8I-J）。
8. 免疫療法對(duì)高危和低危人群的益處
接下來，研究人員利用網(wǎng)站工具（http://tide.dfci.harvard.edu/）對(duì)免疫療法在高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群中的療效進(jìn)行了評(píng)估。較高的腫瘤免疫功能障礙和排斥 (TIDE) 評(píng)分意味著免疫逃逸的可能性較高，表明患者從免疫治療中獲益較低。圖 8K結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的 TIDE 評(píng)分顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)組患者。高風(fēng)險(xiǎn)組患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (MSI) 評(píng)分較低（圖 8L），而低風(fēng)險(xiǎn)組患者的 T 細(xì)胞排除評(píng)分較高（圖 8M）。兩組之間的 T 細(xì)胞功能障礙無顯著差異（圖 8N）。
9. 高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群的藥物敏感性潛力分析
研究人員進(jìn)一步預(yù)測(cè)了高危和低危人群對(duì)結(jié)腸癌患者常用藥物的敏感性。圖 9A-F 結(jié)果顯示，低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組對(duì)PD.0325901、METFORMIN、MK.2206、AZD8055、PD.0332991和索拉非尼更敏感，而高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組對(duì)伊馬替尼、拉帕替尼、PHA.665752和 MS.275更敏感（圖 9G-J）。此外，研究人員還通過 CMAP 數(shù)據(jù)庫確定了可用于高危組患者的四種化療藥物的 3D 結(jié)構(gòu)（圖 9K-N）。
10. PCD 相關(guān) lncRNA風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)后價(jià)值的驗(yàn)證
研究人員在臨床收集了96 名結(jié)腸癌患者作為外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，并通過 RT-qPCR 檢測(cè)8 個(gè) PCD 相關(guān) lncRNA 在結(jié)腸癌和鄰近組織中的表達(dá)，表達(dá)趨勢(shì)與TCGA 中的趨勢(shì)一致（圖 10A）。根據(jù)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)將患者分為高危組和低危組。生存分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組的 OS 顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖 10B）。AUC顯示該風(fēng)險(xiǎn)模型可以預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的結(jié)果（圖 10C）。此外，臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的單因素和多因素Cox 回歸分析顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、分期和年齡是獨(dú)立的預(yù)后因素（圖 10D、E）。
11. 沉默 U62317.4 可抑制結(jié)腸癌的增殖、侵襲和遷移
研究發(fā)現(xiàn)lncRNA U62317.4在預(yù)后模型中具有最高風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，說明U62317.4與結(jié)腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，所以研究人員進(jìn)一步探討了 U62317.4 是否參與結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用 si-U62317.4 轉(zhuǎn)染后，U62317.4 在 HCT-116 和 SW480 細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（圖 11A、B）。沉默 U62317.4 可顯著抑制細(xì)胞活力和克隆形成（圖 11C-E）并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡（圖 11F、G）。此外，敲除 U62317.4 可顯著降低傷口愈合能力以及細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖 11H、J）。為評(píng)估 U62317.4 在體內(nèi)的致瘤性，研究人員構(gòu)建了裸鼠皮下腫瘤模型，結(jié)果顯示沉默 U62317.4可顯著抑制這些小鼠中結(jié)腸癌的發(fā)展（圖 11K-M）。
本文作者在TCGA中通過共表達(dá)分析篩選出 41 個(gè)預(yù)后 PCD 相關(guān) lncRNA，并根據(jù)聚類分析結(jié)果將結(jié)腸癌患者分組。開發(fā)了一個(gè)包含 8 個(gè) PCD 相關(guān) lncRNA 的預(yù)后模型，發(fā)現(xiàn)具有高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者預(yù)后較差，并且預(yù)后模型具有較高的診斷能力。作者最后還通過濕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了U62317.4 lncRNA 在體內(nèi)和體外的作用，發(fā)現(xiàn)沉默U62317.4 lncRNA可抑制腫瘤增殖和侵襲，促進(jìn)腫瘤凋亡。
參考文獻(xiàn)
Y. Chen, Y. Zhang, J. Lu et al. Characteristics of Prognostic Programmed Cell Death–Related Long Noncoding RNAs Associated With Immune Infiltration and Therapeutic Responses to Colon Cancer. Frontiers in Immunology, 2022, 13
