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全基因組分析，數十年以來，都是先將測序數據，比對到一個線性的參考序列上，之后進行變異檢測。但當樣品和參考基因組存在較大差異，或種群多樣性較高時，受限于線性的參考基因組帶來的比對偏向性，會影響變異檢測的準確性和敏感性。而采用包含已知變異信息的圖結構做參考基因組，基于此進行變異檢測，被稱為泛基因組，是未來大人群研究的新方向。
圖參考基因組范例，其中的每個環狀結構，代表種群上的變異
Science12月16日的論文“Pangenomics enables genotyping of known structural variants in 5202 diverse genomes”，介紹了美國加州大學開發的泛基因組比對工具Griaffe，相比常用的bwa，其速度更快，結合變異檢測工具vg，能夠更準確的檢測長度大于50bp的結構變異。
Griaffe的運行速度，相比之前的圖參考序列比對工具，要快一個數量級，比常用的BWA minimap2，也快了50%，見下圖
對于二倍體，雜合變異的兩種堿基，在比對中所支持的比例理論上應該是50%，偏離該比例，說明比對存在偏向性，在低深度時會影響變異檢測的準確性。下圖對比了使用bwa比對到hg19參考基因組和使用vg-map和Griaffe兩種圖比對工具（比對到基于千人變異構建的圖參考序列）之后使用bcftools mpileup和call進行變異檢測后，不同長度的Indel和SNP中，突變型支持的堿基比例。可以看到兩種圖比對工具，在各個長度都接近50%，但bwa比對，隨著變異長度增長，會出現變異型比例下降的趨勢，這與短序列對較長indel的檢出率下降相關。
在標準品HG002上，比較使用不同比對工具，結合Deep variant進行變異堅持得到的結果，左圖比較的是雜合的snp位點，其中使用Griaffe得出的結果，假陽性和假陰性都更低。而右圖則是比較長于50bp的插入刪除的準確性，可以看到使用Griaffer后，F1在全基因范圍和高可信度范圍，能達到0.9左右，說明Griaffe能以更快的速度，達到和之前的圖比對工具在結構變異檢測上相同的精度。
之前的全基因組研究，受限于方法學，多關注單堿基變異或短的插入刪除，而對結構變異，缺少準確且全面的檢測方法。該論文通過使用三代長讀長序列檢測到的變異為金標準，對不同人群的5202人（包含全部千人基因組的樣本）的結構變異進行檢測，指出使用泛基因組的工具，可基于短序列，對結構變異進行更精準的檢測。
具體流程如下圖，先從比對生成的cram文件中，結合圖參考基因組的index文件，拿到原始的read文件，之后使用Griaffe進行比對，再進行結構變異的變異檢測，其中大部分的計算，都花在比對上，單樣本全流程的核時數在206小時，相比傳統的全基因組分析更快。右圖比較了使用不同的圖參考基因組后，長的插入和刪除的平均F1值，相比之前的結構變異檢測更準。
對得出的結構變異，進行PCA分析，可以得出和snp類似的結果，見下圖，這意味著在人群中，不同種族在結構變異上存在著頻率差異，例如VNTR基因上的變異，在非洲人群中出現的比例超過14%，而在其它人群中低于3%。
Griaffe的安裝和使用都很簡單，github（https://github.com/vgteam/vg）上有編譯好的二進制文件，下載后可在linux平臺直接運行。之后可以基于參考基因組和變異的vcf文件，構建圖參考序列的index文件，推薦選擇和研究人群相近的群體，或者多樣性高的群體變異信息（需包含每個個體的變異情況）
命令如下：
vg construct -r small/x.fa -v small/x.vcf.gz >x.vg
構建好的圖參考序列，可以進行可視化，或壓縮為二進制文件節省存儲。
之后的比對過程，先生成后綴為gam的圖比對結果，之后轉換為常用的bam文件，可進行接下來的變異檢測，命令如下：
vg map -T x.sim.txt -x x.xg -g x.gcsa > aln.gam
vg surject -x x.xg -b aln.gam > aln.bam
新檢出的樣本上的變異，還可以用來擴展參考序列的多樣性，即疊加式的構建更準確的圖參考基因組，該操作的輸入是圖參考序列和比對生成對的.gam文件，輸出是增強后的參考序列，對應的命令是;
vg augment x.vg aln.gam -i -S > aug_with_paths.vg
之后的變異檢測，可以基于bam文件，使用傳統的Deep variant這樣的工具，也可以使用vg，以.gam文件為輸入，通過以下命令得到檢測結果：
vg pack -x x.xg -g aln.gam -Q 5 -o aln.pack
vg call x.xg -k aln.pack > graph_calls.vcf
對于多樣本的情況，可以使用bcftools merge，對檢出的變異進行合并。對于結構變異，該研究中將刪除或插入位置在20bp之內，且序列相似度在80%以上的變異，在群體上合并，據此計算人群頻率，通過RepeatMasker進行功能注釋。
類似基于比對結果，對參考基因組進行增強，將新發現的變異加入參考基因組中，vg也支持輸入為vcf格式的圖參考基因組增強，或使用局部組裝得出的長序列，通過vg mpmap命令比對到參考基因組上，構建描述結構變異多樣性的圖參考序列，之后使用vg concat命令，將圖參考基因組合并，得到用于結構檢測檢測的圖參考序列。
對于轉錄組數據，也可以使用vg進行比對，從而應對不同的可變剪切帶來的比對偏向性。先是基于線性參考基因組，變異信息，和注釋文件，構建圖結構的index
vg autoindex --workflow mpmap -t 4 --prefix vg_rna --ref-fasta small/x.fa --vcf small/x.vcf.gz --tx-gff small/x.gtf
之后進行比對
vg mpmap -n rna -t 4 -x vg_rna.spliced.xg -g vg_rna.spliced.gcsa -d vg_rna.spliced.dist -f small/x_rna_1.fq -f small/x_rna_2.fq > mpmap.gamp
泛基因組分析，是大規模人群基因組未來的發展方向，不論對于人群，動植物還是微生物，使用包含變異信息的圖參考序列，都能更好的應對基因多樣性帶來的偏向性。通過引入高性能圖基因組比對工具griaffe，降低了使用圖參考序列的門檻。具體首先體現在之前的比對工具，相比bwa慢4-5倍，而新工具比bwa更快，其次是通過支持將圖參考序列的比對結果轉換為bam格式，使得現有的變異檢測等分析工具可兼容使用。新研究還通過了大規模人群數據，說明了短序列使用圖參考序列，可以得出準確的結構變異檢測結果，其人群變異攜帶頻率和之前研究相符合。最后，vg還可以基于從頭組裝的結果，構建圖參考基因組，隨著未來de novo組裝研究的增多，這將取代基于變異信息構建的圖參考序列，稱為泛基因組研究的新方向。
