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空間結(jié)構(gòu)的分析離不開相應(yīng)的平臺(tái)，這篇文章使用的測(cè)序技術(shù)有Hi-C，ChIP-seq，ATAC-seq，CUT&Tag，F(xiàn)actory RNA-seq（新生RNA水平），這將RNAPII在基因表達(dá)中的作用與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的作用協(xié)調(diào)展示。這篇文章發(fā)表在期刊期刊: Science Advances，在最近一年的影響因子為14.136比上一年增加了1.02。
背景知識(shí)：
哺乳動(dòng)物染色體是三維實(shí)體。染色體構(gòu)象捕獲(3C)技術(shù)的發(fā)展和擴(kuò)展深刻地更新了我們對(duì)真核染色體的空間組織及其功能和維持的理解。除了粘附素，另一個(gè)以轉(zhuǎn)移DNA而聞名的分子馬達(dá)是RNA聚合酶(RNAP)。然而，它對(duì)染色質(zhì)折疊的貢獻(xiàn)仍然存在爭議。不同的證據(jù)表明，RNAPII與染色質(zhì)的結(jié)合和空間相互作用的不同形成之間存在聯(lián)系。
TAD: topologically associated domain拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域
結(jié)果解讀：
RNAPII是細(xì)胞存活所必需的，因此它的耗盡可能只是短暫的。因此，作者開發(fā)了一個(gè)人類DLD-1結(jié)直腸癌細(xì)胞系，其中最大的RNAPII亞單位RPB1的N端標(biāo)記有一個(gè)微小AID(MAID)結(jié)構(gòu)域。作者用DOX/生長素處理2小時(shí)可使RNAPII蛋白水平降低60%以上，而用Western blotting評(píng)估，14小時(shí)的處理可使RNAPII蛋白水平降低80%以上，而不影響RNAPI或RNAPIII水平(Fig. 1A)。為了進(jìn)一步描述細(xì)胞系，作者使用針對(duì)RPB1中mClover標(biāo)簽的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(CHIP-SEQ)。聚合酶降解伴隨著轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSSs)染色質(zhì)的顯著降低(Fig. 1B)，這與最近用小鼠胚胎干細(xì)胞(MESCs)發(fā)現(xiàn)的相似。作者還查詢了H3K27ac(標(biāo)記活性染色質(zhì))和H3K27me3組蛋白修飾(標(biāo)記兼性異染色質(zhì))。當(dāng)RNAPII耗盡時(shí)，觀察到顯著的H3K27ac降低伴隨著H3K27me3水平的升高。接下來，作者探索在RNAPII耗盡時(shí)，間期染色質(zhì)的空間組織是否也發(fā)生了變化。作者將原位Hi-C應(yīng)用于G1期分選的DLD-1-RPB1-MAID細(xì)胞、用生長素處理的細(xì)胞、不用生長素處理的14小時(shí)細(xì)胞和雷公藤甲素處理的細(xì)胞。G1細(xì)胞的使用消除了S/G2期細(xì)胞產(chǎn)生的異質(zhì)性，以生成更詳細(xì)的Hi-C圖。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，圖像只顯示出A-/B-compartments的邊際差異(Fig. 1, C and D)。在對(duì)照的4110個(gè)細(xì)胞中，小于20%的Hi-C數(shù)據(jù)在RNAPII缺乏的細(xì)胞中發(fā)生變化，TADS也只顯示了輕微的干擾(Fig. 1, E and F)。在生長素/雷公藤甲素處理的細(xì)胞中可以檢測(cè)到227個(gè)新的TADs，并在它們的邊界顯示出強(qiáng)化的絕緣現(xiàn)象(Fig. 1F)。TADS內(nèi)/周圍的交互信息文件顯示，以TAD內(nèi)部交互為代價(jià)，對(duì)其邊界的定義更強(qiáng)(Fig. 1G)。到目前為止，作者的數(shù)據(jù)與最近在mESCs中觀察到的結(jié)果相吻合。然而，作者也在生長素處理的細(xì)胞中檢測(cè)到>1500個(gè)loop。這些細(xì)胞明顯大于對(duì)照細(xì)胞或在不同條件下共享的細(xì)胞(Fig. 1, H and I)。其中，生長素和生長素/雷公藤甲素處理的細(xì)胞共有的805個(gè)loop也更大，并在錨定處表現(xiàn)出更高的絕緣性(Fig. 1, H到J)。為了理解這些更強(qiáng)的loop的出現(xiàn)，作者計(jì)算了它們形成的環(huán)域內(nèi)累積的新生RNA表達(dá)水平。與來自控制單元的所有l(wèi)oop或共享loop相比，這805個(gè)loop明顯更多地與頂部loop結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)。總而言之，作者的數(shù)據(jù)揭示了間期急性RNAPII耗竭時(shí)TAD和loop組織水平上的微妙但可辨別的影響。
由于RNAPII缺失對(duì)異步化細(xì)胞群體中的間期染色質(zhì)組織沒有明顯影響，作者推測(cè)RNAPII缺失可能與有絲分裂后染色質(zhì)折疊的重建有關(guān)。這是基于兩個(gè)觀察結(jié)果：第一，對(duì)有絲分裂到G1轉(zhuǎn)變過程中染色質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)的描述：在有絲分裂到G1轉(zhuǎn)變中，順式元件之間的接觸形成早而快，通常與CTCF/粘附素?zé)o關(guān)；第二，在轉(zhuǎn)變的早期，所有活性增強(qiáng)子和基因中，超過50%的基因表現(xiàn)出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄尖峰。為了研究有絲分裂退出后染色質(zhì)的重折疊，作者使用CDK1抑制劑RO3306（阻斷約90% G2細(xì)胞）在G2-M檢查點(diǎn)同步了MAID-RPB1細(xì)胞(Fig. 2, A和B)。然后通過有絲分裂將它們釋放到G1期。清除抑制劑6小時(shí)后，>70%的細(xì)胞重新進(jìn)入G1期，并通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)收集(Fig. 2, A和B)。RNAPII的降解通過分級(jí)、全細(xì)胞印跡、Ser5磷酸化的RNAP的免疫熒光和新生RNA的5-乙炔基-UTP(EUTP)標(biāo)記得到證實(shí)(Fig. 2C)。染色質(zhì)中豐富的SWI/SNF染色質(zhì)重構(gòu)體亞基的水平發(fā)生了變化，但CTCF的介入基本保持不變(Fig. 2C)。接下來，作者對(duì)經(jīng)生長素處理或不經(jīng)生長素處理的G1-REENTRY細(xì)胞進(jìn)行了Hi-C實(shí)驗(yàn)。結(jié)合3D-DNA FISH證實(shí)RNAPII降解引起染色體間互作增強(qiáng)而染色體內(nèi)互作減弱，compartment邊界明顯模糊(Fig. 2D)，A-和B-compartment節(jié)段之間>1 Mbp(百萬個(gè)基本配對(duì))距離處的相互作用變得更強(qiáng)(Fig. 2E)。作者觀察強(qiáng)烈且廣泛的domain結(jié)構(gòu)、局部insulation和loop形成的缺失(Fig. 2, F和G)。在對(duì)照細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的所有4500個(gè)TAD中，insulation都減弱了。在沒有RNAPII的情況下，沒有重建的10%的TAD邊界中的insulation甚至更弱(Fig. 2H)。RNAP耗盡的REENTRY細(xì)胞也比對(duì)照細(xì)胞有更少和更大的TADS (Fig. 2I)，表明邊界坍塌和TAD合并。這些效應(yīng)與RNAPII和活性組蛋白標(biāo)記在TAD邊界的富集是一致的(Fig. 2J)。在loop水平上，RNAPII耗盡的細(xì)胞基本上丟失了1900個(gè)，同時(shí)出現(xiàn)了超過1150個(gè)新的和明顯更長的loop(Fig. 2K)。在對(duì)照和生長素處理的reentry細(xì)胞中檢測(cè)到的2443個(gè)loop在沒有RNAPII的情況下被削弱，同時(shí)在它們的錨定處也顯示出減少的insulation (Fig. 2, K - M)。作者再一次比較了無基因表達(dá)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域和具有高分位數(shù)新生RNA水平的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域。作者發(fā)現(xiàn)，在這兩種情況下，insulation都明顯減弱(Fig. 2N)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，RNAPII與染色質(zhì)折疊的重建有關(guān)，并且它的耗盡會(huì)影響loop的形成。
考慮到拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOP2A/B）對(duì)RNAPII動(dòng)態(tài)的局限影響，研究者想確定G1-reentry細(xì)胞中TOP2缺失是否可以解釋RNAPII缺失所產(chǎn)生的影響，因而應(yīng)用攜帶/未完全敲除TOP2B基因并純合表達(dá)mAID-tagged TOP2A的大腸癌細(xì)胞系HCT116。先驗(yàn)證了生長素對(duì)TOP2A/B的降解作用，聯(lián)合FACS得到G1-reentry細(xì)胞，并分析新生RNA水平以及所有層級(jí)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。多種數(shù)據(jù)分析表明RNAPII降解對(duì)染色質(zhì)重折疊造成的影響無法由TOP2A/B降解概括，而是以聚合酶為中心。
耗盡RNAPII的G1-reentry細(xì)胞的HI-C數(shù)據(jù)顯示A/Bcompartment混合、TAD侵蝕和loop的差別損失/增益。作者繼續(xù)研究了生長素處理后reentry細(xì)胞中CTCF/粘附素亞基水平的變化。Western blotting顯示染色質(zhì)上的CTCF、SMC1A或Rad21水平波動(dòng)很小，這在免疫熒光定量中得到了證實(shí)(Fig. 3, A和B)。為了了解作者的發(fā)現(xiàn)是否是由于NIPBL和CTCF核分布的變化，作者對(duì)這些因素進(jìn)行了超分辨定位。雙色dSTORM在對(duì)照組和生長素處理的G1-reentry細(xì)胞中產(chǎn)生了以下觀察結(jié)果。首先，當(dāng)RNAPII耗盡時(shí)，NIPBL定位在較小的簇中。同時(shí)，作者在擴(kuò)展和變形的簇中也觀察到了更多的局域化現(xiàn)象(Fig. 3C)。其次，CTCF簇的平均大小沒有改變，但在對(duì)照細(xì)胞中，50%的CTCF簇位于<129px2，而在生長素處理的細(xì)胞中，50%位于<82px2(Fig. 3C)。這些結(jié)果，以及染色質(zhì)上NIPBL/MAU2/WAPL水平的變化，暗示在沒有RNAPII的情況下，異常的粘附素(很可能)加載到染色質(zhì)上，并預(yù)測(cè)最終在CTCF結(jié)合位點(diǎn)的粘附素將會(huì)減少。為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，作者在對(duì)照和生長素處理的reentry細(xì)胞中生成了SMC1A和Rad21 Cut&Tag數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)全基因組CTCF位點(diǎn)的粘附素信號(hào)顯著減少(Fig. 3D)。作者發(fā)現(xiàn)，CTCF位點(diǎn)讀數(shù)的減少伴隨著生長素處理的reentry細(xì)胞中映射到非活性TSSs的信號(hào)增加20%到30%，以及廣泛存在的基因間信號(hào)增加>11%(Fig. 3E)。因此，CTCF位點(diǎn)粘附素占有率的普遍減少會(huì)損害全基因組的loop形成(Fig. 3E)。值得注意的是，盡管通過ATAC-seq(測(cè)序分析)判斷出CTCF近端可及性沒有減少，這些變化還是發(fā)生了(Fig. 3F)。RNAP耗盡的TSSs中的ATAC-SEQ信號(hào)顯著增加(Fig. 3G)，染色質(zhì)上的TBP(TATA盒結(jié)合蛋白)水平也是如此(Fig. 3A)。
為了剖析RNAPII和粘附素重新裝載到染色質(zhì)之間的聯(lián)系，作者轉(zhuǎn)向染色質(zhì)折疊的電子模擬。假設(shè)大多數(shù)粘附素(90%)發(fā)生在RNAPII占據(jù)的TSSs處(隨機(jī)加載10%)，作者模擬了對(duì)照染色質(zhì)折疊。經(jīng)過多次迭代，作者的模型生成了一個(gè)類似于Hi-C數(shù)據(jù)的平均關(guān)聯(lián)地圖(Fig. 4, A和B)。作者觀察到了：loop的形成明顯被削弱(Fig. 4, C和D)，但更大的loop大小與作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符(Figs. 2, K 、L和 3E)。因此，作者的模型表明，不能通過RNAPII結(jié)合位點(diǎn)加載粘附素，這足以解釋實(shí)驗(yàn)觀察到的主要染色質(zhì)折疊差異。為了直接研究RNAPII和粘附素之間的相互作用，作者設(shè)計(jì)了一維模擬。作者觀察到oop的形成和錯(cuò)綜復(fù)雜的區(qū)域劃分 (Fig. 4E)。RNAP的耗盡消除了區(qū)域化現(xiàn)象，loop頻率再次明顯降低。loop再次變大的同時(shí)，粘附素占有率降低。建模表明實(shí)驗(yàn)中的主要染色質(zhì)折疊差異可以通過RNAPII結(jié)合位點(diǎn)無法加載黏連素來解釋，并且推斷出實(shí)驗(yàn)中觀察到的效果可以通過RNAP占據(jù)位點(diǎn)的黏連素與轉(zhuǎn)錄活性和loop擠壓之間的相互作用之間的簡單關(guān)系來說明。
全文小結(jié)：
作者發(fā)現(xiàn)了環(huán)擠出對(duì)RNAPII的依賴性，RNAPII在退出有絲分裂后主導(dǎo)著基因組重組。這種依賴性可能說明了有絲分裂的重要性，因?yàn)門F與有絲分裂染色質(zhì)的關(guān)聯(lián)可以決定RNAP的定位、粘附素的加載和環(huán)的擠出。然而，聚合酶、TF和粘附素亞基在這一轉(zhuǎn)變過程中的確切相互作用仍有待進(jìn)一步闡明。
參考文獻(xiàn)：
Zhang S, Ubelmesser N, Josipovic N, et al. RNA polymerase II is required for spatial chromatin reorganization following exit from mitosis. Sci Adv 2021; 7(43): eabg8205.
