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大家好呀！今天給大家介紹一篇2021年2月發表在nature communications（IF:14.919）上的文章。本研究對10例鼻咽癌（NPC）腫瘤-血液的176447個細胞進行單細胞轉錄組測序，得到53種細胞亞型，包括腫瘤浸潤性CD8+ T細胞，調節性T細胞（Treg），樹突狀細胞（DCs）和惡性細胞。CD8+ T細胞和免疫抑制性TNFRSF4+ Treg細胞可能分別來源于血液CX3CR1+ CD8+ T細胞和初始Treg細胞。此外，作者鑒定到具有免疫調節和耐受性LAMP3+ DCs細胞。作者還鑒定到LAMP3+ DCs細胞，Treg細胞，耗竭CD8+ T細胞和惡性細胞之間的細胞間相互作用。總的來說，作者的研究揭示了鼻咽癌在單細胞水平上的腫瘤微環境的異質性和相互作用，為鼻咽癌發展機制和鼻咽癌精確治療提供了有價值的信息。
Tumour heterogeneity and intercellular networks of nasopharyngeal carcinoma at single cell resolution
鼻咽癌單細胞水平的腫瘤異質性和細胞間網絡
結果：
1.鼻咽癌患者腫瘤和PBMC細胞的組成
對10例鼻咽癌（NPC）患者的腫瘤組織和外周血單核細胞（PBMC）進行單細胞轉錄組測序（圖1a）。質控和過濾后共獲得176447個細胞，包括腫瘤細胞82622個和PBMC細胞93825個，每個細胞約有1500個基因。使用R包Seurat對數據進行UMAP聚類共鑒定到CD4+ T細胞，CD8+ T細胞，髓系細胞，惡性細胞，B細胞和NK細胞（圖1b）。與PBMC相比，腫瘤組織中CD8+ T細胞和B細胞比例較多而NK細胞比例較少，表明腫瘤組織和外周血之間的免疫情況不同（圖1c）。此外，作者使用公共單細胞數據集比較NPC和其他癌癥的細胞組成，NPC中T細胞比例較高。
2. T細胞異質性和TCR多樣性
接下來，作者研究T細胞和NK細胞的異質性和潛在功能亞型。作者將141875個T細胞和NK細胞分為32個亞型，主要為CD4+ T細胞和CD8+ T細胞（圖2a）。為鑒定細胞類型特異表達基因，作者對T細胞簇進行差異分析。在腫瘤樣本的CD4+和CD8+ T細胞中LAG3,TIGIT,PDCD1,CTLA4等標志物過表達。已有研究表明腫瘤浸潤T細胞中衰竭基因和效應基因共表達。總的來說，T細胞具有抗腫瘤作用，但他們的功能在TME中受到一定抑制。然而在PMBC中T細胞中的TCF7,SELL,CCR7和LEF1高表達。此外，作者在腫瘤組織中鑒定到特異表達的初始T細胞標志物和促炎細胞因子。接下來，作者進行TCR分析，有38720個T細胞具有可檢測的TCRα-β對或克隆型T細胞。患者中CDR3序列變異最多，其中CAVRGTGTASKLTF和CASSFSGANVLTF與VDJ數據庫中的MLANA和EBV抗原識別有關。此外，腫瘤樣本的CD4+和CD8+ T細胞具有更多的克隆型T細胞。
3. CD8+ T細胞多樣性和腫瘤內CD8+ T細胞的衰竭
在NPC樣本中鑒定到62244個CD8+ T細胞，分為11個亞群，包括兩個na?ve，血液中心記憶，血液效應記憶，高遷移，腫瘤中心記憶，腫瘤效應記憶，腫瘤中心記憶，高增殖和耗竭T細胞等（圖2a和2b）。NPC腫瘤組織中大多數為CD8_C6_IL7R,CD8_C7_GZMK,CD8_C8_MHC,CD8_C9_XCL,CD8_C10_MKI67和CD8_C11_PDCD1，而PBMC中大多數為CD8_C5_CX3CR1,CD8_C1_LEF1,CD8_C2_TCF7,CD8_C3_KLRB1和CD8_C4_KLRG1。為評估CD8+ T細胞的功能狀態，作者計算CD8+ T細胞簇的細胞毒性，增殖和衰竭打分，其中CD8_C5_CX3CR1的細胞毒性打分最高，CD8_C10_MKI67的增殖打分最高，CD8_C11_PDCD1的衰竭打分最高，表明他們具有潛在的細胞毒性，增殖和衰竭功能。差異分析表明CD8_C5_CX3CRA中趨化因子受體，S1P受體和整合素高表達，其負責調控CD8+ T細胞的遷移。差異基因的富集分析表明，腫瘤細胞毒性CD8+ T細胞簇富集于細胞因子產生和淋巴細胞激活等相關通路，CD8_C5_CX3CR1富集于白細胞跨內皮細胞遷移和白細胞遷移相關通路。時序軌跡分析表明，CD8_C5_CX3CR1細胞處于初始狀態，CD8_C10_MKI67處于中間狀態，CD8_C11_PDCD1處于最終狀態（圖2c）。CD8_C11_PDCD1和CD8_C10_MKI67的遷移率最高，其次是CD8_C7_GZMK,CD8_C8_MHC和CD8_C9_XCL1（圖2d），CD8_C5_CX3CR1在CD8+ T細胞中的擴張流動性最高（圖2e），CD8_C5_CX3CR1在腫瘤組織和PBMC中的TCR比例最高（圖2e）。
4.NPC中Tregs細胞的多樣性和軌跡
Treg細胞是免疫細胞的有效抑制因子，對免疫耐受和穩態十分重要。本研究共鑒定到11631個Treg細胞，共四個亞群。腫瘤組織中Tregs的細胞比例較高，腫瘤組織中大多數為Treg_C4_TNFRSF4細胞，Treg_C2_HSPA1A和Treg_C3_MKI67細胞，而PBMC中大多數為Treg_C1_SELL細胞。使用R包Seurat計算Treg細胞的IL2R打分研究Treg細胞的免疫調節功能，其中Treg_C4_TNFRSF4的IL2R打分最高，其抑制和共刺激打分最高（圖3a）。此外，Treg_C4_TNFRSF4中趨化因子受體的表達水平較高，包括CXCR3,CXCR6和CCR8。通路富集分析表明，Treg細胞參與不同的通路。其中，Treg_C4_TNFRSF4富集于細胞因子-細胞因子受體互作（圖3b），Treg_C4_TNFRSF4和Treg_C2_HSPA1A富集于白細胞介素-10生存，TNF信號通路和NF-KB信號通路（圖3b）。GSEA分析表明Treg_C4_TNFRSF4和Treg_C2_HSPA1A的細胞周期、趨化因子、TGF-β和T細胞增殖負調控相關通路富集程度較高。隨后對腫瘤組織和PBMC的Treg細胞進行軌跡分析（圖3c）。TCR分析表明有17621個Tregs細胞為克隆型，其中Treg_C4_TNFRSF4的克隆細胞比例最大。Treg_C4_TNFRSF4的擴增打分最高，表明克隆擴增程度最高（圖3d）。PBMC中的Treg_C1_SELL的遷移打分最高，表明遷移率最高（圖3d）。差異分析表明Treg_C1_SELL中趨化因子受體CCR4高表達。進一步研究Treg_C2_HSPA1A和Treg_C4_TNFRSF4與其他Treg細胞的移動性，Treg_C4_TNFRSF4細胞和Treg_C3_MKI67細胞的遷移率最高，其次是Treg_C2_HSPA1A和Treg_C1_SELL細胞，Treg_C2_HSPA1A細胞與Treg_C4_TNFRSF4和Treg_C3_MKI67細胞的過渡遷移率較高（圖3e）。
5. NPC樣本中B細胞多樣性
共鑒定到22892個B細胞，分為9個亞群。其中，B_C1_TCL1A、B_C2_FCRL3和Plamsa_C1_IgA簇來自PBMC，其他6個簇來自腫瘤樣本。差異分析表明腫瘤組織中B細胞簇的獨特基因特征，B_C6_HSPA1A具有應激基因表達，Plasma_C2_IgG中IgH基因表達水平較高。相關性分析表明TCL1A表達水平與IGHM和IGHD高度相關。差異分析的富集分析表明，B細胞簇中富集與免疫調節相關的通路。
6. NPC中腫瘤相關LAMP3+ DCs具有耐受性表型
共鑒定到8893個髓細胞，分為10個亞群，包括肥大細胞，5個單核細胞或巨噬細胞，4個樹突狀細胞（圖4a）。樹突狀細胞中，DC_C2_CD1C、DC_C3_LAMP3和DC_C4_JCHAIN來源于腫瘤，DC_C1_FCER1A來源于外周血，其中DC_C3_LAMP3具有具有高度成熟，激活和遷移潛能的DCs（圖4b）。此外，DC_C3_LAMP3細胞具有高表達的特殊趨化因子配體(CCL17、CCL19和CCL22)，這些配體能夠召集表達趨化因子受體CCR4、CCR7和CXCR3的免疫細胞(圖4b)。標記基因LAMP3與DC_C3_LAMP3中與成熟、遷移、激活和趨化因子配體相關的其他功能基因的表達顯著相關。GO和KEGG功能和通路富集分析表明，DC_C2_CD1C的“抗原加工和呈遞”顯著上調，而DC_C3_LAMP3的“抗原加工和呈遞”下調，DC_C3_LAMP3中凋亡、NF-κ b和MAPK信號通路以及髓細胞分化上調（圖4c）。DC_C3_LAMP3的分化和凋亡水平最高，但抗原提呈水平最低(圖4d)。軌跡分析表明，DC_C1_FCER1A細胞分化為DC_C2_CD1C和DC_C3_LAMP3兩個分支，其中DC_C3_LAMP3細胞的偽時間打分最高，即分化和成熟程度最高（圖4e）。結合免疫調節和抗原呈遞評分，這些結果表明外周血中的DC_C1_FCER1A細胞可能浸潤到腫瘤，轉化為抗原呈遞能力增強的DC_C2_CD1C細胞，并轉化為免疫抑制的DC_C3_LAMP3細胞(圖4e)。
7. 不同EBV狀態的惡性細胞的異質性
在NPC樣本中鑒定到2787個惡性上皮細胞（圖5a）。由于EBV與NPC惡性轉化和腫瘤發生有關，作者分析惡性細胞中EBV的表達水平并將其分為EBV+和EBV-惡性細胞（圖5b和5c）。EP_C1_LMP1細胞中EPHA2和EGFR高表達（圖5d），與EBV易感性有關。此外，EBV編碼蛋白（LMP1）的免疫熒光染色實驗表明鼻咽癌中存在EBV+惡性細胞和EBV-惡性細胞（圖5e）。通路富集分析顯示EP_C1_LMP1富集細胞因子介導的、細胞死亡、凋亡和癌癥相關通路的調控(圖5f)。
8. NPC的細胞內互作網絡
為研究NPC的細胞通訊網絡，作者使用CellPhenoDB軟件研究NPC組織是PBMC的不同細胞簇間潛在的配體-受體結合。DC_C3_LAMP3細胞、Treg細胞和CD8_C11_PDCD1之間存在抑制、共刺激分子或趨化因子強烈的細胞相互作用(圖6a,和圖6b)。其中，DC_C3_LAMP3細胞通過CCL17-CCR4和CCL22-CCR4與外周血Treg_C1_SELL細胞相互作用（圖6a）。Treg_C4_TNFRSF4細胞上CTLA4、ENTPD1、CSF1高表達，DC_C3_LAMP3細胞上配體受體結合CD80/CD86，提示Treg_C4_TNFRSF4與DC_C3_LAMP3細胞之間存在潛在的相互作用（圖6a）。DC_C3_LAMP3細胞通過CD200- CD200R信號通路與CD8_C11_PDCD1細胞相互作用，是一個參與抑制抗腫瘤反應的非經典免疫抑制途徑（圖6b）。Treg_C4_TNFRSF4與CD8_C11_PDCD1細胞之間存在潛在的配體-受體相互作用，包括趨化因子(CCL4-CCR8)、粘附連接(ITGAL-ICAM1和SELPLG-SELL)和免疫調節(HAVCR2-LGALS9)（圖6b）。這些結果表明，DC_C3_LAMP3、Treg_C4_TNFRSF4和CD8_C11_PDCD1細胞在NPC腫瘤中廣泛存在免疫調節相互作用。免疫熒光染色表明DC_C3_LAMP3細胞中CD80表達，Treg細胞中CTLA4表達，DC_C3_LAMP3細胞中PD-L1表達，CD8+ T細胞中PD-1表達（圖6c和6d）。在惡性細胞和免疫細胞中，EBV+ EP_C1_LMP1細胞中存在更多的受體-配體相互作用。EP_C1_LMP1-細胞中的CX3CL1與CD8_C5_CX3CR1細胞、DC_C1_FCER1A細胞、NK細胞和單核細胞中的CX3CR1存在相互作用，表明EP_C1_LMP1細胞對外周血免疫細胞具有趨化潛能。以上結果表明，NPC患者中存在廣泛的細胞間相互作用。
結論：
以上結果表明，作者從單細胞水平全面分析了鼻咽癌患者的腫瘤微環境異質性并鑒定可能參與鼻咽癌發生的重要細胞和分子，為了解鼻咽癌的發展機制和潛在的治療策略提供有價值的信息。然而，本研究還存在一定局限性還需要一定的功能驗證來研究其細胞間互作網絡的潛在機制。
