單細胞測序助力免疫紅細胞亞群

導讀

眾所周知，紅細胞是動物體內血細胞中數量最多、作用最強的細胞。它能夠攜帶氧氣和二氧化碳，使人體內部碳氧量保持平衡。紅細胞被認為是非免疫細胞，非免疫細胞也可以在人體內發揮免疫調節作用。然而，紅系細胞在個體發育過程中免疫調節功能的分子和細胞機制仍然不清楚。

背景知識

下文中，作者對來自人卵黃囊、胎肝、早產兒臍血(UCB)、足月臍帶血(UCB)和成人骨髓(BM)的紅系細胞進行單細胞轉錄組研究，發現紅系前體的經典和免疫亞群具有不同的分化軌跡。在整個人類個體發育過程中，免疫紅系細胞從卵黃囊到成年骨髓都存在，但在體外不能從人類胚胎干細胞中產生。與經典紅系前體細胞相比，這些免疫紅系細胞具有紅系和免疫雙重調節作用。同時，免疫紅系細胞與各種免疫細胞和獲得性免疫細胞相互作用更頻繁。

結果解讀

• scRNA-seq分析確定了一個有免疫傾向紅系亞群

作者首先對卵黃囊（YK）、胎肝（FL）和足月新生兒臍帶血（UCB）不同發育階段進行了單細胞轉錄組測序。然后，作者在每個發育階段從這些定義的紅系簇中提取Gypa表達陽性細胞(Gypa⁺)，用于進一步分析。Gypa⁺細胞主要由紅系前體細胞組成，包括前紅細胞、嗜堿性紅細胞、多染紅細胞和正染紅細胞，Gypa⁺紅系前體的降維和無監督聚類產生了表達紅系特異性基因(GypA、HBE1、HBG2和HBB)的四個主要簇(C1-C4) (圖1a-c)。為了研究這些簇的生物學相關性，作者用每個簇的特征基因進行了GO富集分析。C1與mRNA分解代謝、翻譯啟動和RNA剪接有關(圖1d，e)；C3具有活躍的細胞周期，核分裂和有絲分裂細胞周期過程顯著富集(圖1d，e)；C3具有氧氣轉運和珠蛋白基因表達(圖1d，e)，表明C3中的細胞比C1和C2中的細胞成熟。C4獨特地富集到了與免疫活性有關的條目，如抗原處理和呈遞(例如，HLA-DRA、HLA-E和CD74)(圖1e)。RNA速率分析有助于通過區分未剪接和剪接mRNAs來預測單個細胞的發育狀態，這表明紅系細胞從C1到C3(圖1f)逐漸成熟，這與紅系成熟評分一致。而C4紅系細胞顯示出不同的發展軌跡(圖1F)，這通過PAGA (partition-based graph abstraction，該軌跡分析可以估計了集群之間的連通性)軌跡分析(圖1G)進一步驗證。綜上所述，對紅系前體細胞的scRNA-seq分析可以將有核紅系細胞分為經典紅細胞簇(C1-C3)和免疫紅細胞團簇（C4）。

• YS、FL和UCB紅系前體細胞的獨特特征

為了研究人類紅系細胞在不同發育階段中的分子變化，作者對來自不同發育階段的細胞進行了比較分析。如圖2a-c，差異表達基因（DEGs）的GO富集分析表明YS、FL和UCB中C1、C2和C3在代謝過程的特征。其中，金屬硫蛋白基因MT2A、MT1G和MT1H以及鋅轉運蛋白基因ZNT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)的表達是YS-C3細胞的特征(圖2c，d)。基因集富集分析(GSEA)和基因表達動力學證實了與金屬離子穩態相關的基因在YS-C3細胞中的高表達(圖2e)。此外，YS-C3細胞還富集到了與糖酵解、核糖體生物發生和G2/M期轉變相關的基因(圖2f-h)。另外，通過比較分析，作者發現循環中的YS紅系細胞可能是支持胚胎發育的關鍵金屬轉運體，也可能是確保向胚胎提供金屬供應的儲存庫。

• 在hESC衍生的紅細胞生成中，缺乏免疫傾向的細胞

人類胚胎干細胞(hESC)向紅系分化可用于研究早期胚胎紅細胞的生成。為此，作者用白細胞介素3(IL-3)、干細胞因子(SCF)、促紅細胞生成素(EPO)和地塞米松誘導人胚胎干細胞向紅系分化。在分化第14天，流式細胞儀檢測GypA⁺CD71⁺細胞（圖3a）。將第4天、第11天和第16天的Gypa⁺紅系細胞整合在一起進行分析，并將其劃分為三個簇(hESC-C1至hESC-C3)(圖3b)。特征基因和GO富集分析表明，hESC-C1細胞與核糖體生物合成相關(如RPL3、RPS2和RPL12)，而hESC-C3細胞與氧運輸和氣體運輸有關(如HBA1、HBA2和HBG2) (圖3c，d)。在hESC-C1和hESC-C3細胞中大量表達的特征基因概括了體內C1和C3簇的特征(圖3e)。相關分析表明，hESC來源的紅系細胞與YS和FL來源的紅系細胞關系更密切(圖3f)。與YS-C1至YS-C3細胞相比，hESC-C1至hESC-C3之間顯示出更高的凋亡率、有絲分裂和鐵死亡 (圖3g，h)。相反，在YS-C1到YS-C3細胞中表達的基因在一些生物學過程中高度富集，如蛋白質折疊、RNA分解代謝過程和線粒體翻譯延長(圖3g，h)。總體而言，hESC來源的紅系細胞部分概括了體內胚胎紅系細胞的特征，但未能表現出免疫特征。

• 免疫紅系細胞發揮免疫調節功能

CD71⁺或CD71⁺VISTA⁺有核紅系細胞通過細胞間直接相互作用或分泌細胞因子(例如轉化生長因子β(TGF-β))來調節免疫反應(圖4a)。作者在C4亞群中檢測到VSIR(編碼VISTA)和TGFB1的高表達，以及IL1B、IL7和TNFSF10等細胞因子基因的表達(圖4b)。在C4細胞中，與免疫受體活性相關的基因的表達普遍較低(圖4c)，這表明它們產生免疫信號并將其傳遞給其他細胞。接下來，作者使用單細胞調控網絡推理和聚類(SCENIC)來識別經典紅系簇(C1-C3)和免疫紅系簇(C4)中的主要調節子和基因調控網絡(GRN)（圖d-e）。為了在實驗中捕獲免疫紅系細胞，作者篩選了在C4細胞中高表達和特異表達的表面標記。CD63在C4細胞中的表達最高(圖4f)。流式細胞儀檢測顯示，Gypa⁺CD71⁺CD63⁺細胞在FL和UCB中分別占2.58%和6.36% (圖4G-I)。FL組織切片的免疫組織化學(IHC)染色檢測Gypa⁺紅系前體細胞CD63的表達(圖4J)。作者對分選的FL Gypa⁺CD71⁺CD63⁺細胞進行了scRNA-seq。非監督聚類劃分了不同的經典簇和免疫簇(圖4k)。免疫簇中的細胞比經典簇中的細胞有更高的免疫反應相關基因的表達，占免疫表型定義的GypA⁺CD71⁺CD63⁺細胞室總數的77.9%(圖4 l，m)。因此，免疫紅系C4細胞在免疫表型定義的GypA⁺CD71⁺CD63⁺細胞室中高度富集。此外，免疫組化染色檢測到FL組織切片中GypA⁺CD63⁺細胞表達免疫標志性蛋白，如HLAE和TNF-β(圖4n)。為了深入了解免疫紅系前體細胞的功能，分離了UCB-GypA⁺CD71⁺CD63⁺細胞，與外周血單個核細胞(PBMC)共培養，在經LPS處理的GypA⁺CD71⁺CD63⁺-PBMC培養中，促炎癥細胞因子的表達增加，包括IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子、MIP-1α和MIP-1β(圖4o)。將GypA⁺CD71⁺CD63⁺和GypA⁺CD71⁺CD63^?細胞與CD11b⁺PBMC共培養，細胞內細胞因子染色顯示，與GypA⁺CD71⁺CD63⁺細胞共培養后，CD11b⁺細胞中腫瘤壞死因子的表達增加(圖4p，q)。綜上所述，免疫偏向的紅系前體發揮免疫調節功能，參與免疫細胞的炎癥反應。

• 免疫紅系細胞在成人骨髓中持續存在

為了研究成人骨髓中免疫紅系細胞亞群的存在，作者從7名健康人的骨髓中分離出GypA⁺ITGA4⁺SLC4A1^+/?紅系前體細胞。ScRNA-seq鑒定了四個轉錄簇，命名為BM-C1至BM- C4(圖5a，b) 。BM-C4中的DEGs和GO富集分析表明潛在的免疫相關功能(圖5c)。在BM-C4中高表達的基因主要與白細胞-細胞黏附、淋巴細胞激活和吞噬功能的調節相關(圖5c，d)。與經典紅系BM-C1至BM-C3簇相比，關鍵免疫功能基因以及表面標志在BM-C4細胞中高表達(圖5e)。在成人骨髓中發現Gypa⁺CD71⁺CD63⁺免疫紅系細胞(圖5f，g)。細胞內細胞因子染色顯示CD11b⁺細胞與BM Gypa⁺CD71⁺CD63⁺細胞共培養后TNF表達增強(圖5h，i)。對YS、FL、UCB和BM不同發育階段免疫紅系細胞的比較分析表明，與成人BM相應群體的特征相比，YS、FL和新生兒UCB階段的免疫紅系細胞具有更大的相似性(圖5j-k)。總體而言，具有免疫調節功能的免疫前體出現在YS中，并在成年BM中持續存在

• 免疫--紅系細胞主動與免疫細胞相互作用

CD71⁺紅系細胞的免疫調節作用可以通過直接的細胞-細胞相互作用來介導，但很少有配體-受體對CD71⁺紅系細胞與其他免疫細胞類型的相互作用。為了闡明紅系免疫細胞免疫調節功能的潛在機制，作者使用CellPhoneDB對免疫紅系細胞和其他免疫細胞群體表達的潛在配體-受體對進行了廣泛的研究，該工具可以從單細胞轉錄數據集中預測兩種細胞之間的相互作用。總體而言，在所有發育階段中，免疫紅系和免疫細胞之間比經典紅系和免疫細胞呈現出更顯著地的細胞-細胞間相互作用(圖6a)。具體來講，細胞-細胞相互作用分析證實了免疫紅系細胞和巨噬細胞之間的相互作用(圖6b、c)。另外，與經典的紅系細胞不同，免疫紅系細胞不僅與巨噬細胞活躍地相互作用，而且與其他免疫細胞相互作用 (圖6d-e)。但在不同發育階段，作者僅在YS免疫紅系細胞和巨噬細胞之間檢測到強烈相互作用(圖6f)。這些數據表明，免疫紅系細胞與各種免疫細胞表現出廣泛的、活躍的相互作用，這可能是其免疫調節功能的基礎。

全文總結：

該研究構建了人類有核紅細胞從胚胎到成年的全面細胞圖譜，揭示了人類早期胚胎紅細胞獨特的分子特征；還成功鑒定和驗證了免疫紅細胞亞群的存在，開拓了有核紅細胞的新功能研究領域，免疫紅細胞亞群作為免疫調控網絡中的新成員，有望進一步研究它們在各種疾病中的免疫調節作用。

參考文獻

1. Xu C, He J, Wang H, et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies an immune-prone population in erythroid precursors during human ontogenesis. Nat Immunol. 2022.