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今天給大家分享一篇2023年2月7日發(fā)表在Nature Communications （IF:17.694）上，通過(guò)單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組的整合分析解析前列腺癌免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境的文章。
Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses
一．研究背景以及研究方法
前列腺癌（PCa）是一種臨床異質(zhì)性疾病。低風(fēng)險(xiǎn)原發(fā)性前列腺癌的治療只需要積極監(jiān)測(cè)，而高風(fēng)險(xiǎn)疾病則需要多模式治療，包括手術(shù)、放射治療和激素治療。轉(zhuǎn)移性疾病的復(fù)發(fā)和發(fā)展仍然是一個(gè)臨床問(wèn)題，對(duì)免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素尚不清楚。在這里，研究者綜合描述了前列腺癌的腫瘤微環(huán)境（TME），并與癌旁組織樣本和健康對(duì)照進(jìn)行了比較。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組相結(jié)合分析腫瘤背景相關(guān)的基因表達(dá)變化。經(jīng)研究，作者發(fā)現(xiàn)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境與抑制性髓系細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞以及高基質(zhì)血管生成活性有關(guān)。
二．研究結(jié)果
1、前列腺癌TME的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組圖譜
從19名診斷為前列腺腺癌并接受根治性前列腺切除術(shù)的未接受治療的患者中采集新鮮前列腺癌樣本。在19名患者中的15名患者中，對(duì)腫瘤附近匹配的“正常”良性前列腺組織進(jìn)行了采樣。作為對(duì)照，從5名患者的健康前列腺組織（圖1a）。共計(jì)得到179359個(gè)單細(xì)胞，并基于細(xì)胞類型特異性基因注釋細(xì)胞類型，形成16個(gè)主要簇（圖1b，1c）。由于作者旨在關(guān)注前列腺免疫TME，他們的分離方案被優(yōu)化以富集免疫細(xì)胞（圖1d）。就主要細(xì)胞群的豐度而言，當(dāng)將腫瘤與癌旁進(jìn)行比較時(shí)，在漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到顯著但微小的差異（圖1e）。他們使用加權(quán)表達(dá)距離檢查樣本之間轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的總體相似性，發(fā)現(xiàn)顯示與正常和健康組分相比，腫瘤組分之間患者間變異性顯著增加（圖1f）。這表明不同患者腫瘤區(qū)域的細(xì)胞狀態(tài)軌跡不同。
為了從空間層面驗(yàn)證單細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，作者使用Slide-seqV2進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)。從兩個(gè)健康前列腺樣本和兩個(gè)前列腺腫瘤樣本（一個(gè)LG Gleason評(píng)分和一個(gè)HG Gleason得分）及其相應(yīng)的相鄰正常組織中采集新鮮冷凍10微米切片（圖1g）。基于scRNA-seq參考數(shù)據(jù)，使用RCTD算法對(duì)Slide-seqV2空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積。正如預(yù)期，與scRNA-seq數(shù)據(jù)相比，Slide-seqV2測(cè)量結(jié)果顯示細(xì)胞比例的差異更為顯著，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞數(shù)量大大增加，免疫細(xì)胞比例顯著減少（圖1d）。
通過(guò)Slide-seqV2觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成與標(biāo)準(zhǔn)H&E染色的預(yù)期一致。健康前列腺組織的高度詳細(xì)的空間結(jié)構(gòu)顯示，組織良好的前列腺上皮腺體被免疫和非免疫基質(zhì)細(xì)胞包圍，包括成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（圖1g，圖1）。這種結(jié)構(gòu)在前列腺癌中被明顯破壞（圖1g，圖3和圖4）。組織組織的差異通過(guò)使用Moran I評(píng)分的空間自相關(guān)來(lái)量化，該評(píng)分評(píng)估細(xì)胞聚集（高分）或分散（低分）的程度。與健康組織相比，腫瘤中的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞Moran I評(píng)分顯著減少（圖1h）。
2. 前列腺癌基因Signature區(qū)分正常和惡性上皮細(xì)胞
根據(jù)無(wú)監(jiān)督聚類，得到了四種上皮亞群：Basal、Luminal、Club和Hillock（圖2a）。隨后，作者使用RNA Velocity推斷上皮細(xì)胞的分化軌跡。一個(gè)軌跡表明，Club充當(dāng)Luminal的祖細(xì)胞。第二個(gè)軌跡表明Hillock可能充當(dāng)Luminal的祖細(xì)胞（圖2b）。作者使用InferCNV分析，從腫瘤內(nèi)的正常管腔細(xì)胞中分離出惡性Luminal細(xì)胞（具有大片段拷貝數(shù)變異）。差異表達(dá)基因（DEG）分析用于識(shí)別惡性細(xì)胞的表達(dá)特征，得到由八個(gè)基因組成的gene signature（圖2c）。鑒于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。與來(lái)自三種不同樣本類型（健康、癌旁和腫瘤）的非惡性管腔上皮細(xì)胞相比，惡性細(xì)胞顯示出顯著更高的EMT基因特征（圖2d）。
在空間上，健康前列腺組織顯示出有組織的腺上皮，具有良好結(jié)構(gòu)的基底細(xì)胞和管腔細(xì)胞雙層（圖2e）。癌旁樣本隨著管腔上皮群體的擴(kuò)大和組織良好的腺體的丟失而不同（圖2e）。使用RCTD反卷積上皮亞群，并使用四種不同上皮亞群的關(guān)鍵標(biāo)記基因進(jìn)行驗(yàn)證（圖2e，2f）。如空間自相關(guān)所示，在健康前列腺組織中觀察到的Club和Hillock細(xì)胞在腫瘤和鄰近正常組織中被破壞（圖2e）。將由單細(xì)胞數(shù)據(jù)中獲得的前列腺癌gene signature用于評(píng)估Slide-seqV2數(shù)據(jù)中的腫瘤細(xì)胞注釋。該8個(gè)基因成功地識(shí)別了HG病例中的腫瘤富集區(qū)域（圖2g）。在健康和癌旁樣本中幾乎沒有腫瘤細(xì)胞被注釋（圖2g），這證明了“前列腺腫瘤基因特征”的準(zhǔn)確性。
3. 前列腺腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)出高內(nèi)皮血管生成活性
作者共鑒定了五個(gè)基質(zhì)亞群，包括兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、兩個(gè)周細(xì)胞和一個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（圖3a）。Endothelial-1亞群表現(xiàn)SELE/SELP/CLU/PLVAP基因的高表達(dá)，而Endothelial-2亞群則表現(xiàn)出共同的動(dòng)脈基因（HEY1/IGFBP3/FBLN5）上調(diào)。GO通路分析表明Endothelial-2參與血管發(fā)育和血管生成的途徑（圖3b）。并且，與其他基質(zhì)群體相比，腫瘤內(nèi)的Endothelial-2的血管生成得分最高（圖3c）。在Slide-seqV2空間轉(zhuǎn)錄組中比較了“腫瘤”和“腫瘤鄰近”環(huán)境中的Endothelial-2的轉(zhuǎn)錄組變化（圖3d）。空間轉(zhuǎn)錄組中Endothelial-2的通路富集分析與單細(xì)胞數(shù)據(jù)一致，顯示血管生成和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通路的上調(diào)（圖3e）。并且與正常和健康樣本的組織良好的結(jié)構(gòu)相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)腫瘤中該亞群處于一種特別分散的狀態(tài)（圖3f，3g）。
此外，作者還鑒定了兩個(gè)周細(xì)胞亞群（圖3a）。Pericyte-1中富集細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和結(jié)締組織發(fā)育的通路，而Pericyte-2則與血管平滑肌細(xì)胞一致的肌肉收縮相關(guān)通路（圖3b）。此外，與健康前列腺相比，癌旁組織樣本中的兩種周細(xì)胞亞群的血管生成評(píng)分顯著增加（圖3c）。在空間上，與健康和相鄰正常樣本相比，Pericyte-1細(xì)胞分散在腫瘤樣本中（圖3f，3g）。總之，這些數(shù)據(jù)表明周細(xì)胞在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中在血管生成和腫瘤間質(zhì)重塑中的作用。
4. 腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用
作者利用Slide-seqV2空間轉(zhuǎn)錄組來(lái)探索腫瘤內(nèi)細(xì)胞之間的潛在互作（圖4a）。分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間具有405個(gè)顯著的配體-受體相互作用（圖4b）。隨后，他們研究了將腫瘤細(xì)胞作為配體來(lái)源和基質(zhì)細(xì)胞作為表達(dá)受體時(shí)（圖4c），腫瘤細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA和VEGFB），可通過(guò)VEGF受體、FLT143和β-1整合素刺激Endothelial-2。這些現(xiàn)象可能解釋腫瘤相關(guān)Endothelial-2亞群狀態(tài)中促血管生成的變化（圖3e）。他們還觀察到腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（COL9A2-ITGA1）以及腫瘤細(xì)胞和Pericyte-2細(xì)胞（COL12A1-ITGA1）之間的潛在相互作用，這兩種通路都參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑和細(xì)胞遷移（圖4c）。反向相互作用（即，基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)腫瘤受體配體）的分析揭示了成纖維細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF1）刺激腫瘤細(xì)胞IGF1受體介導(dǎo)的潛在相互作用（圖4d）。已知IGF途徑通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和激活細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和存活。IGF1-IGF1R相互作用的Slide-seqV2分析證實(shí)了表達(dá)IGF1R的腫瘤細(xì)胞和表達(dá)IGF1的成纖維細(xì)胞的共定位（圖4e）。
5. 前列腺癌中富含免疫抑制性髓系細(xì)胞
對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，得到了三個(gè)單核細(xì)胞、三個(gè)巨噬細(xì)胞和一個(gè)髓系DC（mDC）亞群,并且通過(guò)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞gene signature進(jìn)行驗(yàn)證（圖5a，5b和5c）。單核細(xì)胞亞群的特征為CD16hi（CD16hi-Mo），其被稱為非經(jīng)典單核細(xì)胞，以及腫瘤炎性單核細(xì)胞（TIMo），其具有CD14的高表達(dá)（圖5b）。第三個(gè)亞群被注釋為單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞（Mo-MΦ），是一種單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的過(guò)渡細(xì)胞狀態(tài)。由于PCa患者的免疫抑制性TME與髓系衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）的積累相關(guān)，作者在TIMo細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)MDSC基因簽名得分最高（圖5c），與健康前列腺組織相比，癌旁與腫瘤中的TIMo細(xì)胞的MDSC基因簽名顯著更高（圖5d）。這表明TIMo通過(guò)免疫抑制活性在前列腺腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。
隨后，他們確定了三個(gè)巨噬細(xì)胞亞群（圖5a），包括腫瘤炎性巨噬細(xì)胞（TIMΦ）具有比較高的“炎癥基因簽名”、抗原呈遞巨噬細(xì)胞（AP MΦ）具有比較高的“抗原處理和呈遞基因簽名”，以及M2巨噬細(xì)胞（M2-MΦ）具有比較高的“M2基因簽名”（圖5c）。M2-MΦ顯示出從健康樣本到腫瘤樣本的細(xì)胞豐度逐漸增加（圖5e）。
在與單細(xì)胞表達(dá)相同的組織樣本上原位進(jìn)行的多重免疫組化（mIHC）證實(shí)，與匹配的相鄰正常組織相比，CD68+巨噬細(xì)胞和CD68+CD163+M2MΦ在腫瘤組織中的浸潤(rùn)更高（圖5f）。在高Gleason評(píng)分（4+4、4+5、5+5）的病例中，M2-MΦ對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的量化更為明顯（圖5f）。M2-MΦ表達(dá)高水平的參與血管生成的基因，如血管生成因子EGFL757和腫瘤轉(zhuǎn)移如LYVE158和NRP159，表明M2-MΦ浸潤(rùn)在腫瘤內(nèi)血管生成中的作用。
6. 前列腺癌癥的特征是T細(xì)胞耗竭和免疫抑制Treg活性
適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在建立針對(duì)腫瘤的有效的抗原特異性免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。根據(jù)無(wú)監(jiān)督聚類，將淋巴細(xì)胞分為了四個(gè)CD4+T細(xì)胞、三個(gè)CD8+T細(xì)胞和兩個(gè)NK亞群（圖6a，6b）。CD8+T細(xì)胞的功能狀態(tài)使用細(xì)胞毒性基因特征進(jìn)行分析。有趣的是，與影響免疫治療效果的“冷”腫瘤相比，“熱”腫瘤中三種不同CTL的T細(xì)胞毒性得分顯著更高（圖6e）。此外，作者發(fā)現(xiàn)與健康前列腺組織相比，CTL-1和CD8+效應(yīng)細(xì)胞都表現(xiàn)出更高的T細(xì)胞耗竭基因信號(hào)的表達(dá)（圖6c），并且腫瘤和癌旁樣本中的耗竭分?jǐn)?shù)更高（圖6d）。
CD4+T細(xì)胞被細(xì)分為na?ve型、Th1型、Th17型和Treg（圖6b）。作者發(fā)現(xiàn)與鄰近正常和健康樣本相比，從腫瘤中收集的Treg中的Treg活性得分明顯更高（圖6f）。值得注意的是，腫瘤壞死因子受體超家族TNFRSF9、TNFRSF18和TNFRSF4的基因在浸潤(rùn)腫瘤的Tregs中高度表達(dá)。這些受體結(jié)合腫瘤壞死因子、參與炎癥相關(guān)致癌物和支持免疫抑制TME的促炎細(xì)胞因子。
7. 髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞間的相互作用
Tregs和MDSC是兩個(gè)對(duì)癌癥免疫耐受很重要的免疫抑制細(xì)胞群。這兩種人群在腫瘤部分中都表現(xiàn)出高抑制活性，并且它們之間的相互作用先前已在不同的癌癥中報(bào)道過(guò)。基于此，作者分析了腫瘤樣本及其鄰近正常組織中TIMo中MDSC評(píng)分和Treg中Treg活性評(píng)分之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組中，MDSC評(píng)分和Treg活性評(píng)分顯著相關(guān)，LG和HG Gleason患者之間沒有明顯區(qū)別（圖7a）。在相鄰的正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（圖7a）。隨后檢查了兩個(gè)亞群之間顯著的潛在配體-受體相互作用。數(shù)據(jù)顯示CCL20-CCR6分別是TIMo和Tregs之間相互作用的重要信號(hào)軸之一（圖7b）。CCL20在TIMo中高度表達(dá)，其同源受體CCR6主要在Treg、Th1和Th17中表達(dá)（圖7c，圖7d）。幾項(xiàng)研究表明，CCL20信號(hào)通過(guò)招募Treg和/或Th17，在增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲性和化療耐藥性方面發(fā)揮作用。
為了驗(yàn)證CCL20-CCR6軸是否參與PCa的免疫抑制性TME，作者將RM1-PCa細(xì)胞系皮下注射到C57BL/6J野生型（WT）小鼠中。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到300-400mm3時(shí)，用CCL20阻斷抗體單獨(dú)或與免疫檢查點(diǎn)阻斷（抗PD-1）聯(lián)合治療小鼠。使用CCL20阻斷抗體阻斷CCL20-CCR6相互作用顯著降低了RM1腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)抗PD-1沒有組合效應(yīng)（圖7e），表明CCL20-CRR6軸參與前列腺癌免疫抑制性TME。
四、總結(jié)
總的來(lái)說(shuō)，這個(gè)對(duì)原發(fā)性前列腺腫瘤樣本及其正常對(duì)照進(jìn)行單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組的整合分析為了前列腺癌研究人員提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證腫瘤與癌旁免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系，將有助于更好地了解前列腺癌的進(jìn)展，并將為這種常見疾病確定新的治療靶點(diǎn)。目前，這種將單細(xì)胞與空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合分析出機(jī)制，然后用濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方式已經(jīng)成為單細(xì)胞相關(guān)文章主流方向！心動(dòng)的話，趕快行動(dòng)起來(lái)吧！
