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2021年6月29日，一篇題為“m5C-Related lncRNAs Predict Overall Survival of Patients and Regulate the Tumor Immune Microenvironment in Lung Adenocarcinoma”的文章發表在Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF:6.684）上。文章創新性的研究了RNA甲基化的另一種常見形式——5-甲基胞嘧啶（m5C）對肺腺癌預后的影響，為科研工作者研究m5C對癌癥的預后提供了借鑒思路。
研究背景
甲基化是常見的 RNA 轉錄后修飾方法，5-甲基胞嘧啶（m5C）是常見的 RNA 甲基化修飾方法之一。據報道，m5C 基因座參與了多種生物過程，包括 RNA 的結構穩定性和代謝、tRNA 識別和應激反應。此外，m5C 修飾也與癌癥進展密切相關。
長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是主要的非編碼 RNA，是長度超過 200 nt 的轉錄本。已知它們在染色質重塑、轉錄和轉錄后調控中發揮關鍵作用。此外，lncRNA 的 RNA 甲基化已被證明會影響癌癥進展。然而，關于lncRNAs中m5C調控的研究還很少，需要進一步研究。
本研究利用來自癌癥基因組圖譜（TCGA）數據集的 LUAD 中 m5C 相關 lncRNA 的表達數據，篩選出 14 個具有預后價值的 m5C 相關 lncRNA，構建了 m5C 相關 lncRNA 預后模型（m5C-LPS），并進一步分析了m5C-LPS與免疫細胞浸潤亞型的關系。探討肺腺癌（LUAD）中m5C相關lncRNA的RNA甲基化的不同基因特征、預后價值以及對腫瘤免疫微環境（TIM）的影響，以期為LUAD的治療提供指導。
研究結果
1、LUAD與正常肺組織m5C調節因子的差異表達
研究方法與結果：1）為了鑒定LUAD中m5C調控因子的差異表達基因和相關功能，使用TCGA數據庫分別分析了497例LUAD和54例正常肺組織。研究者發現m5C 調節因子的表達在 LUAD 和鄰近正常組織之間存在顯著差異（圖 1A）。
2）使用STRING數據庫構建了14個m5C相關lncRNA的PPI網絡（圖1B）。
① TRDMT1 是該網絡的核心基因，被發現與其他 4 個基因相互作用。然而，當我們進行相關分析時，TRDMT1 并未顯示出與其他基因的強相關性（圖1C）。
② NSUN4、NSUN7、NSUN6、DNMT3B、DNMT3A 和 DNMT1 與其他基因具有弱到中等的相關性，而 NSUN3 和 TET2 的相關性最強（圖 1D）。
研究結論：以上結果表明LUAD中m5C調節因子之間存在一定的相互作用。
2、鑒定具有重要預后價值的 m5C 相關 lncRNA
研究方法與結果：1）從 TCGA 數據庫中，結合 LUAD 生存數據確定了 1094 個 m5C 相關的 lncRNA，并進行了單變量 Cox 回歸分析以確定具有重要預后價值的 m5C 相關的 lncRNA。研究結果揭示了 53 個與癌癥風險相關的 m5C 相關 lncRNA。其中，46 個 m5C 相關 lncRNA 被證明是保護因素，而其中 7 個是高危因素。使用多變量 Cox 回歸進一步分析，在 53 個 m5C 相關的 lncRNA 中，14 個 m5C 相關的 lncRNA 被揭示具有預后價值（表 1）。
2）研究者構建了一個共表達網絡，用于可視化 LUAD 中 14 個 m5C 相關的 lncRNAs-mRNA。研究者發現與 TET2 （n = 11） 共表達的 lncRNA 數量最多，其次是 NSUN7 （n = 8） 和 NSUN3 （n = 7）。與 SH3BP5-AS1 共表達的 mRNA 數量最多（n = 6），共表達的 lncRNA 是主要的保護因素（圖 2A、B）。
3）使用 GEPIA 在線數據庫分析共表達網絡中相關基因的表達強度發現 m5C 相關的 lncRNA 和 m5C 基因之間存在弱相關性，其中 TRDMT1 和 LINC00578 之間的相關性最強，其次是 ALYREF 和 TMPO-AS1，m5C 相關 mRNA 的表達與 lncRNA 的表達呈正相關（圖 2C）。
4）根據獲得的風險評分公式和中位風險值將 1344 名 LUAD 患者分為高風險組和低風險組。
① Kaplan-Meier 生存分析顯示，高危組的 OS 比低危組差（圖 3A），表明風險評分具有預后價值。
② 風險曲線和散點圖說明 LUAD 患者的風險評分與相應生存狀態之間的關系（圖 3B），風險評分越高，死亡率越高。
研究結論：確定了具有重要預后價值的 m5C 相關 lncRNA，并基于 14 個 m5C 相關 lncRNA 建立了 m5C-LPS 預后模型。
3、m5C相關lncRNA差異表達與臨床病理變量的相關性
研究方法與結果：1）研究者對 14個m5C 相關的 lncRNA 進行了單變量分析，并根據單個基因的表達將患者分為高表達組和低表達組。其中，ABALON、AL034397.3、NKILA、TMPO-AS1高表達組患者的OS低于低表達組。相比之下，AC005911.1、AC090948.1、AC106047.1、AC124045.1、AL513550.1、HLA-DQB1-AS1、LINC00654、AL035701.1、SH035701.573BP3高表達組患者的OS高于低表達組（圖 4A）。
2）m5C-LPS高危組和低危組的病理分期、T分期和生存狀態存在顯著差異。然而，沒有發現性別、年齡、N 期和 M 期有任何顯著差異（圖 4B）。
3）對 m5C 相關 lncRNA 與臨床病理特征之間的相關性進行了深入分析，發現在 T 階段，5 個 lncRNA 在組間表現出顯著差異。同樣，發現 7 個 lncRNA 在 N 階段的不同組之間顯示出顯著差異。關于 M 和 S 階段，分別鑒定了 2 和 6 個 lncRNA，不同組之間存在顯著差異。有趣的是，研究者檢測到 AL034397.3 的表達在所有（T、N、M 和 S）階段的各組中有所不同，表明這可能是核心預后基因（圖 4C）。
4、m5C-LPS預后模型的驗證和列線圖的構建
研究方法與結果：1）使用單變量和多變量 Cox 回歸分析來確定 m5C-LPS 是否可以用作獨立的預后因素。在單變量 Cox 回歸分析中， HR = 1.157，而在多變量 Cox 回歸分析中，HR = 1.282。表明風險評分作為重要的預后因素可能與年齡、性別、病理分期和 TNM 分期無關（圖 5A）。
2）為了評估其預測LUAD患者預后的特異性和敏感性，研究者評估了風險評分的ROC曲線下面積（AUC）值。風險評分在 1、3、5 年的 AUC 值分別為 0.760、0.754 和 0.779，這些被證明高于其他臨床病理因素（圖 5B）。同時，利用風險評分構建列線圖，可作為臨床實踐中預測患者預后的定量工具（圖5C）。
研究結論：以上結果表明m5C-LPS是LUAD患者的重要獨立預后因素。
5、低風險和高風險群體的 m5C 狀態差異
研究方法與結果：1）使用 PCA 檢測 m5C 在全基因組表達譜、m5C RNA 修飾相關基因表達譜和 m5C-LPS 相關 lncRNAs 表達譜上的不同分布模式（圖 6A）。 基于m5C-LPS，將患者分為低危組和高危組，與其他2種方法相比，低危組和高危組的分布更明顯。 因此，m5C-LPS 可以將 LUAD 患者分為 2 組，表明預測模型的敏感性和特異性。
2）為了識別 m5C 相關 lncRNA 的異常激活信號通路進行了 GSEA，分析結果表明，m5C 相關 lncRNA 的高表達與細胞周期信號通路、DNA 復制和 P53 信號通路有關（圖 6B）。
6、m5C-LPS與LUAD腫瘤免疫微環境的相關性
研究方法與結果：1）通過使用 CIBERSORT 篩選 p < 0.05 的值，CD4 幼稚 T 細胞在高風險組和低風險組中不表達，并被排除在外（圖 7A）。
2）分析 21 種腫瘤浸潤免疫細胞與 m5C-LPS 之間的相關性發現，其中單核細胞、樹突細胞靜息和靜息肥大細胞在高危組中的表達高于低危組。相比之下，高風險組中活化的 M0 巨噬細胞和肥大細胞的水平低于低風險組（圖 7B）。
3）進一步分析21種腫瘤浸潤細胞之間的相關性發現，激活的 CD4 記憶 T 細胞與 CD8 T 細胞的相關性最強，其次是漿細胞和 M2 巨噬細胞（圖 7C）。
4）研究 m5C-LPS 風險評分與腫瘤浸潤免疫細胞之間的關系表明，風險評分與 6 種腫瘤浸潤免疫細胞亞型（B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）呈負相關（圖 7D）。
研究結論： m5C-LPS的風險特征可以區分LUAD中腫瘤免疫細胞的不同特征。
文章小結
lncRNAs與肺腺癌（LUAD）患者的預后密切相關，研究者使用 Pearson 相關分析構建了一個 5-甲基胞嘧啶 （m5C） 相關的 lncRNAs-mRNAs 共表達網絡。然后使用單變量和多變量 Cox 比例風險分析來確定具有預后價值的 m5C 相關 lncRNA 的風險模型。使用 Kaplan-Meier 分析、單變量和多變量 Cox 回歸分析和患者病理特征曲線分析驗證風險模型。研究者還在體外驗證了 m5C 相關 lncRNA 的表達水平。使用 CIBERSORT 工具和 TIMER 數據庫評估風險模型與腫瘤浸潤免疫細胞之間的關聯。基于這些分析，總共選擇了 14 個具有預后價值的 m5C 相關 lncRNA 來構建風險模型。m5C 相關 lncRNA 的風險模型可能是 LUAD 有前景的預后工具，并可能有助于LUAD患者的治療。
全文鏈接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.671821/full
