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今天跟大家分享的是發表在ONCOIMMUNOLOGY（IF: 8.110）上的一篇文章，主要是對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)在EGFR/ ALK陽性非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤免疫微環境中的作用進行探究。TKI在攜帶EGFR突變和ALK重排的非小細胞肺癌治療過程中發揮關鍵作用。然而，TKI對腫瘤免疫微環境(TIM)的影響尚未完全闡明。因此，研究者們對TKI治療前后EGFR/ ALK陽性的NSCLC樣本進行RNA測序和全外顯子測序，結合新抗原和突變負荷分析，使用xCell和單樣本基因集富集分析(ssGSEA)評估腫瘤免疫細胞浸潤與活性。此外，還基于基因加權相關網絡分析識別與治療和免疫應答相關的hub基因并在公共數據集合中進行驗證。
綜合分析表明酪氨酸激酶抑制劑(TKI)誘導EGFR/ ALK陽性非小細胞肺癌腫瘤免疫微環境重構
Comprehensive analyses reveal TKI induced remodeling of the tumor immune microenvironment in EGFR/ALK-positive non small-cell lung cancer
1.數據
本文數據包括來自于公共數據集的TCGA肺腺癌數據，GSE11969中34例EGFR突變肺癌樣本的微陣列數據和自測的osimertinib（TKI靶向藥物）治療前、后樣本的RNA表達數據。
2. TKI用藥前后的EGFR突變和ALK重排患者的轉錄組改變
基于t檢驗分別識別EGFR突變和ALK重排的肺腺癌患者在TKI治療和響應后發生差異表達的基因（FDR<0.05），其中1442個基因在治療后的EGFR突變和ALK重排患者中同時表達上調，1425個基因同時表達下調（圖1A-B）。GO富集分析表明，上調的差異基因與免疫應答顯著相關，下調的差異基因主要與細胞粘附和連接等過程相關（圖1C）。對只在EGFR突變或ALK重排的肺腺癌患者中發生差異表達的基因進行分析，發現與ALK重排患者相比，EGFR突變患者的差異基因被更多的富集到免疫和細胞周期相關通路（圖1D-E）。此外，通過GSEA分析發現TKI顯著調控EGFR突變或ALK重排患者的免疫和細胞周期相關通路（圖1F-G）。綜上所述，研究者認為TKI治療可能改變EGFR突變或ALK重排中TKI應答者的腫瘤微環境。
圖1. TKI用藥后的EGFR突變和ALK重排患者的轉錄組改變
3.TKI治療可重塑EGFR突變或ALK重排患者的腫瘤免疫微環境（TIM）
為了進一步驗證TKI處理對TIM的影響，研究者基于xCell方法計算EGFR突變或ALK重排患者治療前后免疫，微環境和和基質相關打分。TKI治療后，不管是在EGFR突變還是ALK重排患者中，免疫打分、微環境打分和基質打分均顯著升高(圖2A-B)。此外，研究者還基于ssGSEA對TKI處理前后樣本中16種細胞的浸潤水平進行評估。其中， CD8 + T細胞、自然殺傷細胞(NK)等抗腫瘤活性細胞在TKI治療后顯著增加(圖2C)。 另外，多種免疫過程相關基因在TKI治療后EGFR突變或ALK重排患者中發生表達上調（圖2D）。然而，一些與抗原呈遞相關的基因下調(如CALR、CANX和PDIA3，圖2D)，這可能是在TKIs治療后ALK重排應答者中T細胞浸潤有限的原因。此外，研究者還發現在TKI治療后的新抗原負荷和突變負荷減少（圖2E-F），這可能導致ALK重排樣本在TKI治療期間抗原呈提減弱并限制隨后的T細胞抗腫瘤反應。
圖2. TKI治療可重塑EGFR突變或ALK重排患者的腫瘤免疫微環境
4.TKI治療前后體細胞突變的改變
EGFR突變或ALK重排患者的TKI耐藥主要由獲得性突變引起，但對應答后樣本的體細胞突變還沒有進行充分研究。因此，研究者對TKI治療前后樣本的體細胞突變進行分析，最終發現在TKI治療后，多個個體的NEFH發生突變(圖3A-C)。另外，在TCGA攜帶EGFR突變或ALK重排肺腺癌患者中，NEFH低表達患者有更長的總生存時間和無進展生存時間（圖3D-E），表明NEFH是肺腺癌的促癌因子。
為研究NEFH突變與免疫之間的關系，研究者將TKI治療前的baseline打分減去TKI治療后的打分，最終得到免疫細胞的相對浸潤評分。研究者發現NEFH突變患者的中性粒細胞豐度顯著低于NEFH野生型樣本(圖3F)。另外，Spearman相關分析表明在EGFR 19Del/L858R突變或EML4-ALK融合的TCGA肺腺癌患者中，NEFH表達與中性粒細胞浸潤呈正相關(圖3G)。與治療前樣本相比，CXCL2等中性粒細胞趨化相關的基因在NEFH突變樣本中的表達明顯減少(圖3H)。
綜上所述，以上發現表明TKI抑制劑誘導NEFH發生功能缺陷突變，可能導致中性粒細胞浸潤減少，預后更好。然而，細胞毒性細胞的相對水平未見明顯變化，表明NEFH突變可能不是TKI處理后細胞毒性細胞浸潤增加的主要原因(圖3F)。
圖3. TKI治療前后體細胞突變的改變
5.基于加權基因相關網絡分析（WGCNA）識別TKI誘導免疫重構過程中的hub基因
為進一步探索TKI誘導的細胞毒性細胞滲透機制，研究者通過WGCNA分析識別TKI誘導免疫重構過程中的hub基因，基于樣本中變異程度最高的5000個基因構建共表達網絡，最終識別出9個不同的共表達模塊 (圖4A)。并對模塊特征基因與樣本臨床特征(免疫評分、基質評分、微環境評分等)之間的關系進行探究，以識別與臨床特征相關的共表達模塊。研究者發現MEblue模塊與免疫評分、微環境評分等呈顯著正相關，而MEturquoise模塊與TKI治療和免疫評分呈顯著負相關(圖4B)。因此，研究者將重點放在這兩個模塊上，基于cytoHubba插件中提供的bottleneck方法分別識別出兩個模塊中的10個hub基因（圖4C-D）。并計算免疫相關評分(IAS，MEblue模塊中hub基因的平均表達量減去MEturquoise模塊中hub基因的平均表達量)，Spearman相關性分析表明IAS與微環境評分（圖4F）和多種免疫細胞類型存在較強相關性。
圖4. 基于WGCNA識別TKI誘導免疫重構過程中的hub基因
6. 在TCGA和GSE11969數據中基于IAS打分的免疫相關亞型與免疫浸潤、免疫活性和患者預后相關
接著研究者在攜帶EGFR突變或ALK融合的TCGA肺腺癌患者中基于以上過程中識別出的hub基因計算IAS打分，研究者發現IAS打分與細胞毒性細胞浸潤和免疫評分相關(圖5A-B)。為進一步評估IAS的預后價值，研究者將攜帶EGFR突變或ALK融合的TCGA肺腺癌患者基于IAS打分分為兩組，其中IAS得分較高患者的預后顯著優于較低患者 (圖5C-D)。同樣，在GSE11969數據集中，也可以觀察到EGFR突變患者的IAS打分與免疫重構過程和患者生存時間顯著相關(圖5E-F)。
圖5.IAS打分與免疫亞型
最后讓我們來回顧一下本文的主要內容：研究者主要對TKI在EGFR/ ALK陽性非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤免疫微環境中的作用進行探究，發現TKI可以通過誘導免疫微環境重構，激活腫瘤免疫響應過程。然后基于WGCNA識別TKI誘導免疫重構過程中發揮關鍵作用的hub基因并構建IAS打分，并進一步在公共數據集中基于IAS打分將樣本劃分為預后及免疫浸潤程度不同的兩個亞型。
今天的內容就是這些，本篇文章的一個很大優點在于有一手的自測數據，同時很好的結合了公共數據集中的測序數據與預后數據，從多方面論證TKI可以在EGFR/ ALK陽性患者中通過誘導免疫微環境重構，激活腫瘤免疫響應過程。非常值得同學們多多學習哦！
