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N6-甲基腺苷(m6A)是RNA最豐富的表觀遺傳修飾，m6A的失調驅動異常的轉錄和翻譯，促進癌癥的發生和發展。雖然m6A引起的基因調控缺陷經常影響致癌和腫瘤抑制網絡，但m6A也可以調節腫瘤的免疫原性和參與抗腫瘤反應的免疫細胞。理解這一概念有助于設計針對m6A的新藥，以改善癌癥免疫治療的結果。在這里，作者提供了一個最新的和全面的概述：m6A修飾如何內在地影響免疫細胞，以及腫瘤細胞m6A修飾如何外在地影響腫瘤微環境(TME)中的免疫細胞。作者還總結了調節內源性抗腫瘤免疫的策略，并討論重塑TME有哪些挑戰。
文獻解讀：
RNA m6A的修飾過程由三種酶動態和可逆地調節：m6A甲基轉移酶(“writers”)、m6A去甲基酶(“erasers”)和m6A結合蛋白(“readers”)。這些酶共同參與了RNA的正常表達和翻譯在圖1中，作者描述了這樣的動態過程。如圖1，m6A甲基化復合物由核心甲基轉移酶樣蛋白3（METTL3）及其它的甲基轉移酶（writer）組成，將m6A添加到細胞核中的靶RNA上（圖1，①）。而兩種主要的m6A去甲基化酶（eraser）脂肪質量和肥胖相關蛋白（FTO）和alkB同源物5（ALKBH5），可以清除細胞核中的甲基化修飾（圖1，②）。m6A被不同的“readers”識別，如YTHDC1、HNRNPC/G和HNRNPA2B1，它們介導各種轉錄后過程，包括細胞核中的RNA剪接和miRNA處理（圖1，③）。還有在細胞質中，m6A與不同的特異性reader蛋白結合，如IGF2BPs、PRRC2A、YTHDF1/2/3和YTHDC2，它們介導mRNA的穩定性、翻譯和衰變（圖1，④）。
眾所周知，固有的m6A修飾通過靶向不同癌癥中的特定基因來調節腫瘤細胞的命運。
NK細胞：METTL3(a writer)和YTHDF2(a writer)分別針對Ptpn11、STAT5或TARDBP，正向調節NK細胞的存活和抗腫瘤免疫。
巨噬細胞：具體地說，TME中的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)非常具有可塑性的，能夠在不同的環境刺激下切換功能以抑制或促進腫瘤進展。巨噬細胞中的METTL3通過靶向IRAKM(TLR4的抑制劑)或Spred2(ERK途徑的抑制劑)，促進促炎細胞因子的產生，如TNF-α和IL-6，從而重塑TME并抑制腫瘤的進展。METTL14介導的m6A甲基化促進巨噬細胞中Ebi3的降解，促進CD8+T細胞活化，抑制腫瘤生長。
樹突狀細胞(DC)：DC中的YTHDF1可增強編碼蛋白酶的mRNAs的翻譯，該酶可降解溶酶體內的抗原。沒有YTHDF1，溶酶體蛋白水解酶的翻譯減弱，有利于抗原交叉呈遞，并促進更多CD8+T細胞對腫瘤的反應。
CD4+T細胞：在CD4+T細胞中，METTL3抑制SOCS家族蛋白(SOCS1、SOCS3和CISH)的表達，從而抑制JAK，增強IL-7介導的JAK/STAT5的激活，最終促進CD4+T細胞的動態平衡和分化。METTL3還可降低Tcf7mRNA的穩定性，促進T濾泡輔助細胞(Tfh)調節因子的表達，從而促進Tfh細胞的功能成熟。ALKBH5減少m6A對干擾素-γ和C-X-C基序趨化因子配體2 mRNA的修飾，增加其mRNAs的穩定性，促進其蛋白在T細胞中的表達。
調節性T(Treg)：Treg細胞中的METTL3通過m6A修飾降低Socs mRNA的穩定性。這激活了IL-2/STAT5信號，抑制了T細胞效應細胞因子的分泌，降低了TME中效應T細胞(如CD8+T細胞)的抗腫瘤反應。
TME在腫瘤進展中起重要作用，并顯著影響免疫治療的效果。近年來，越來越多的證據表明，腫瘤細胞中的m6A修飾與免疫細胞反應和免疫檢查點阻滯劑(ICBS)的療效有關。腫瘤細胞中m6A修飾的改變影響TME中免疫細胞的浸潤、激活和功能，這使靶向m6A——尤其是靶向腫瘤細胞中的m6A調節因子——成為改進癌癥免疫治療的一種有前途的治療方式。下表是作者精心幫我們整理出來的m6A修飾在重塑腫瘤微環境中的作用。
最近的研究揭示了微生物群和RNA修飾之間的相互作用。全轉錄組測序分析表明，微生物組對m6A修飾有很強的影響。由于缺乏微生物群的暴露，無菌(GF)小鼠大腦和腸道中m6A基因的修飾高于無特定病原體(SPF)小鼠。另一項研究報告，GF小鼠和SPF小鼠在盲腸中有不同的甲基化高峰，這主要與代謝和炎癥途徑有關。一些特定的微生物物種，如Akkermansia
muciniphila和Lactobacillus plantarum，可以直接改變mono-associated小鼠 (只有一個微生物物種定居的動物)的特定m6A修飾。目前，m6A與腸道微生物群在腫瘤發生發展中的關系尚不清楚。據報道，SARS-CoV-2等病毒感染可誘導宿主細胞mRNA的m6A修飾，從而影響宿主對病毒感染的免疫防御。因此，更好地研究腸道微生物與宿主m6A的相互作用可為開發抗癌創新療法提供新的策略。
如上文所述，m6A調節因子，如METTL3、YTHDF1和YTHDF2，通過不同的方式參與抗腫瘤免疫的調節。當然，腫瘤細胞中m6A調節因子的異常表達也可能會導致免疫抑制TME，進一步加速癌癥進展。因此，靶向m6A修飾的目的主要有：1)直接抑制腫瘤細胞生長。2)增強免疫細胞的抗腫瘤能力，如通過增強CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒作用。3) 通過將M2 TAMs重新編程為M1 TAMs來重塑TME。在這里，作者討論了針對m6A修飾用于癌癥免疫治療的策略和挑戰。
m6A調節因子的特異性抑制劑以增強內源性抗腫瘤免疫
人們認識到，大多數m6A調節因子在腫瘤細胞中異常高表達。近年來，針對m6A調節因子（如FTO、ALKBH5、METTL3等）的一系列小分子抑制劑相繼問世，其中FTO是最具吸引力的靶點。2012至2019年間，研究人員開發并鑒定了一系列FTO抑制劑，如大黃酸、MO-I-500、甲氯芬酸(MA)、熒光素、2-羥基戊二酸(R-2HG)、FB23和FB23-2，它們在體外和體內都顯示出顯著的抗腫瘤作用（表二）。
從2020年到現在，FTO抑制劑不斷升級優化，包括CS1/CS2和Dac51，它們不僅可以抑制癌細胞增殖和癌癥干細胞的自我更新，而且還可以提高抗腫瘤免疫(圖3)。如圖3所示，腫瘤細胞中m6A調節因子的抑制劑間接增加T細胞的轉運，減少免疫抑制。
建立一種有效的ACT（adoptive cell therapy）m6A修飾系統
作者的實驗室和另一個小組發現，在小鼠中，m6A調節因子METTL3和YTHDF2及其相應的靶基因Ptpn11(編碼SHP-2)和TardBP(編碼TDP-43)與NK細胞的效應功能和增殖相關。通過慢病毒或逆轉錄病毒介導的METTL3、SHP-2或YTHDF2的過表達，TardBP的敲除或基因編輯METTL3來操縱靶基因Ptpn11 mRNA位點上的m6A甲基化，這可能會改善NK細胞的效應功能和增殖能力(圖4)。目前還沒有人通過m6A調節劑來增強體外培養的人NK細胞的增殖和細胞毒作用。由于m6A調控位點在人類和小鼠之間高度保守，這樣的研究可能有助于產生更多的CAR NK細胞和IPSC來源的NK細胞。除了CAR NK細胞和IPSC來源的NK細胞療法外，CAR T細胞療法是臨床上最成功的癌癥免疫療法之一。如上所述，m6A調節因子，如ALKBH5和METTL3，及其靶向基因影響T細胞功能(圖2D)。因此，調節CAR T細胞中的m6A修飾也可能是一種潛在的增強抗腫瘤免疫反應的策略。
納米顆粒(NPs)平臺已成為癌癥治療的有前途的載體。近年來，科學家們已經開發出能夠準確有效地將mRNAs、siRNAs和藥物（基于蛋白質）輸送到腫瘤細胞中的NPs。最近在肝細胞癌中的研究發現，METTL3可以通過m6A修飾穩定長鏈非編碼RNA-LINC00958，而LINC00958的異常過表達會加速肝細胞癌增殖。此外，將NP包裹的LINC00958 siRNA特異性地運送到TME中的腫瘤細胞中，減少了LINC00958中m6A的修飾，并抑制了肝癌的進展。最近的研究發現，巨噬細胞中的METTL14、METTL3及其靶基因Spred2和IRAKM與腫瘤進展有關。因此，靶向地將NP包裹的Mettl3、Mettl14、Spred2的mRNA或Irakm的siRNA導入TAMs，可以促進TAM極化，減少Treg細胞的浸潤，促進CD8+T細胞的細胞毒功能，逆轉TME中的免疫抑制(圖5)。
那么我們可以從哪些思路研究RNA m6A修飾在腫瘤免疫中發揮的作用呢?
在原發性腫瘤和轉移性腫瘤中發現的癌相關成纖維細胞（CAF）是一種高度可塑的、彈性的細胞，通過與腫瘤微環境中其他細胞類型的復雜相互作用積極參與癌癥進展。除了產生有助于腫瘤基質結構和功能的細胞外基質成分外，CAF還經歷表觀遺傳變化，產生影響腫瘤血管生成、免疫學和代謝的分泌因子、外體和代謝物。由于其假定的促癌功能，CAF長期以來被認為是一個有吸引力的治療靶。考慮到CAFs介導腫瘤侵襲的多種方式，m6A修飾在調節CAFs分泌功能中的作用還有非常大的研究空間。
腫瘤新血管形成的過程，是通過腫瘤的整個細胞組成部分的感應信號的組合和輸出來進行的。在腫瘤血管生成中，激活的許多基因和信號通路與發育的血管生長具有相同的作用，但它們缺乏反饋調節控制，并且受到炎癥細胞和缺氧的高度影響。因此，腫瘤血管是異常的、脆弱的和高滲透性的。因為周細胞和血管平滑肌細胞 (VSMC)都減少。VSMCs 通過維持血管內皮細胞（VECs）的增殖和穩定性促進血管成熟，并通過分泌血管內皮生長因子（VEGF）促進 VEC 存活。此外，除了腫瘤細胞釋放的促血管生成因子（VEGF、TNF-α、TGF-β、PDGF、CXCL12、IL-8/CXCL8）外，VEC 的存活和增殖還受到 TME 中基質細胞分泌因子的調節，如MMP、ROS。經過我的檢索，我發現目前研究的文章還不是很多。比如說METTL3 的敲低顯著激活 Notch 信號并影響人 VEC 的血管生成，并且與異二聚體 Notch E3 泛素連接酶的表達下調有關。值得注意的是，最近有報道稱 METTL3 介導的 m6A 修飾可正向調節 VEGF 表達。而VEGF 能夠與內皮細胞上的 VEGFR2結合，使內皮細胞之間的相互聯系松散，周細胞覆蓋率降低。VEGF被認為是腫瘤血管生成中促進腫瘤轉移的最強和最豐富的特異性血管生長因子。這些發現表明，m6A 可顯著調節 VEGF 表達，這一研究提供了腫瘤血管生成調節的潛在方向。此外，TME 血管生成細胞中 m6A 影響 VEGF 或其他受 m6A 調節影響的關鍵基因的具體機制，如 Notch信號，也很值得研究。
N6-甲基腺苷(m6A)甲基化是真核生物中最常見的RNA內部修飾形式。m6A在正常和異常的生物過程中發揮著多功能的作用，其作用可能因m6A基序的位置而發生很大的變化。程序性細胞死亡(Programmed cell death, PCD)包括凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)、焦亡(pyroptosis)、壞死(necroptomsis)和鐵死亡(ferroptosis)，其中大部分涉及到質膜的破壞。自從m6A通過調節基因表達首次在細胞凋亡中被發現以來，越來越多的研究提出m6A與幾乎所有類型的程序性細胞死亡通路相互作用。在腫瘤中，m6A與腫瘤細胞和非腫瘤細胞凋亡、自噬、焦死、以及鐵死亡的關系。毫無疑問，m6A和程序性細胞死亡通路的也是大家關注的焦點之一。
間充質干細胞是自我更新的多能干細胞，它可調節參與抗腫瘤免疫的所有免疫細胞的表型和功能。作為可塑性細胞，它可根據鄰近腫瘤浸潤免疫細胞的細胞因子決定其表型和功能。根據其所暴露的腫瘤微環境，獲得促腫瘤和抗腫瘤表型，從而增強或抑制腫瘤生長。MSC 和 TME 之間的相互作用很復雜。一方面，MSCs可以作為抗原呈提細胞（APCs），通過激活腫瘤適應性免疫反應直接抑制腫瘤細胞的生長；另一方面，MSCs也以其強大的分化增殖能力參與TME的構建，抑制所有主要類型免疫細胞的激活，有助于腫瘤細胞的逃逸。
迄今為止，m6A 修飾對 MSCs 的影響已在腫瘤轉移部位進行了初步研究，但尚未在原發 TME 中進行。最近報道了 m6A 修飾參與 BMSCs 向成骨細胞的分化機制。在大鼠成骨誘導過程中，BMSCs 中 METTL3 上調，METTL3的敲低抑制分化，這與 AKT 信號傳導中磷酸化的顯著降低密切相關。此外，大量的 BMSCs 也可以被募集到腫瘤部位，參與 TME 的重塑，甚至通過與 TME 的復雜相互作用直接轉化為腫瘤細胞。我覺得m6A 甲基化對 TME 中 MSC的影響會是一個潛在的熱點。
全文總結：
盡管近年來對腫瘤中m6A修飾的生物學后遺癥進行了廣泛的研究，但開發基于m6A的腫瘤免疫治療靶向藥物的策略仍處于起步階段。總體而言，m6A的修飾是動態和可逆的，其許多調節因子尚未被發現。靶向m6A修飾用于癌癥免疫治療是具有挑戰性的。因此，更好地理解這一過程并準確控制其毒性作用仍然是值得進一步研究的重大挑戰。從這一角度出發可以發現很多高質量思路。
參考文獻
1. Li X, Ma S, Deng Y, Yi P, Yu J. Targeting the RNA m(6)A modification for cancer immunotherapy. Mol Cancer Mar 16 2022;21(1):76.doi:10.1186/s12943-022-01558-0 .
