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大家好呀，今天分享的文章的主題為分析非小細胞肺癌（NSCLC）中免疫細胞豐度、免疫細胞之間距離和免疫細胞和腫瘤之間距離對預后的影響，全面描述非小細胞肺癌（NSCLC）的突變和臨床病理背景下的空間免疫表型。文章思路清晰，于近期發表在《European Journal of Cancer》（IF =10）上，讓我們來一起學習一下吧！
Spatial immunophenotyping of the tumour microenvironment in nonesmall cell lung cancer
摘要
腫瘤微環境中的免疫細胞與預后和治療反應有關。本文目的是全面描述NSCLC的突變和臨床病理背景下的空間免疫表型。建立了多重熒光成像管道，以在359例NSCLC病例中對13個免疫細胞亞群進行空間定量：CD 4效應細胞（CD 4-Eff）、CD 4調節細胞（CD 4-Treg）、CD 8效應細胞（CD 8-Eff）、CD 8調節細胞（CD 8-Treg）、B細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、M1巨噬細胞（M1）、CD 163+骨髓細胞（CD 163）、M2巨噬細胞（M2）、未成熟樹突狀細胞（iDC）、成熟樹突狀細胞（mDC）和樹突狀細胞（mDC）以及漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）。
1.NSCLC 空間表型免疫細胞的管道
建立了一個高通量的工作流程，其中包括:
(1) T 和 B 淋巴細胞，自然殺傷(NK)細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞亞群的組織切片多色熒光（mIF）染色 ;
(2)多光譜掃描;
(3)由專家病理學家和基于機器學習的組織和細胞分割的圖像管理;
(4)仔細的數據管理和標記信號的閾值化，隨后的免疫細胞表型分型;
(5)基于標記表達和細胞分割的空間定量。（圖1A）
對359例NSCLC進行管道處理，經過去除不良樣本剩余300個進行后續的分析。將每個免疫面板中不同免疫標記物的表達結合起來，將每個細胞分配到13種免疫細胞亞型中的一種，包括T和B淋巴細胞、巨噬細胞和髓系細胞、NK細胞、自然殺傷T細胞（NKT）和樹突狀細胞（DCs）。（圖1B）
2.NSCLC的免疫景觀
為了研究腫瘤和腫瘤基質中免疫細胞分布情況，比較了13種免疫細胞的浸潤比例，并計算免疫細胞之間的相關性。
圖2A：相對腫瘤而言，CD4 Eff是在腫瘤基質中最為豐富的免疫細胞；相反，iDC、mDC和NK細胞在腫瘤中較為豐富，但是富集量較小。腺癌（AC）和鱗癌（SCC）的免疫環境只有微小差異，經多次檢測調整后無顯著差異。
圖2B：通常高淋巴細胞浸潤伴隨著M1巨噬細胞的豐度，而M2巨噬細胞僅與腫瘤基質中的CD4 Eff和CD8 Eff細胞相關。腫瘤基質中，pDC的豐度與B 細胞的豐度之間有意想不到的聯系。
3. 免疫細胞浸潤、臨床相關因素和存活率
分析了基質和腫瘤中免疫細胞浸潤與年齡、性別、吸煙狀況和分期之間的關系，在調整多重測試后，沒有顯著相關性。作者又分析免疫浸潤比例和生存之間的相關性，在多變量COX回歸分析中（獨立于分期、年齡和體能狀態），所有注釋的免疫細胞的整體的高密度與較長的存活期相關。隨后，作者分析了每個注釋的免疫細胞亞群的預后影響，在NSCLC 隊列中，觀察到 CD4 Eff，CD4 Treg，CD8 Eff，CD8 Treg，B 細胞，M1和pDC與更長的生存期呈正相關，在腺癌和鱗狀細胞癌亞組中也觀察到大多數相關性。調整協變量逐步Cox回歸模型確定了CD4 Eff和CD8 Treg作為最重要的積極的預后參數。結果表明，許多免疫細胞亞群對傳統的臨床參數有良好的預后影響，而且這種影響并不局限于細胞毒性T淋巴細胞。
4. 腫瘤和免疫細胞的空間分析
眾所周知，腫瘤的免疫過程和免疫細胞的數量相關，測序技術的不斷發展，不僅可以觀察到單個細胞的表達情況，也可以觀察到細胞的空間位置。免疫細胞的數量對腫瘤的治療很關鍵，但同時免疫細胞和腫瘤細胞之間的距離也很重要。因此作者通過最近鄰分析來測量了腫瘤和免疫細胞之間的距離。NK-和NKT-細胞由于其豐度較低，無法進行分析。
與腫瘤細胞相關的不同免疫細胞亞群的分布顯示出兩種主要模式，1. 效應CD4, CD8 Eff， M1巨噬細胞和髓樣聚合在腫瘤細胞附近，相比之下，其他免疫細胞在該區域分布更均勻，與腫瘤細胞的平均距離更長；2.成熟的樹突狀細胞表現出相反的形態，且主要位于遠處。
作者又分析了腫瘤細胞和免疫細胞之間的平均距離對總生存期的影響，當分析平均距離時，同樣的免疫細胞也顯示出與基于密度的存活率相關，這可以解釋為距離與密度有關的事實。成熟的樹突狀細胞是個例外，這些細胞與腫瘤細胞的距離越遠，存活時間越長。在調整臨床參數后，僅CD8Eff與腫瘤細胞的距離與生存存在顯著聯系。（圖3）
當對免疫細胞彼此的距離進行分析,發現距離相近的淋巴細胞亞群(CD4 Eff、CD4 Treg 、CD8 Eff, CD8 Treg和B細胞)與長生存期相關。反觀巨噬細胞和樹突狀細胞亞群，這種關系并不清楚。當調整主要的臨床指標時，只有 CD8 Treg 和 B 細胞之間的接近表明與更長的總生存期有關。
接下來，作者又將距離和免疫細胞的豐度相結合來分析和生存之間的相關性，密度與距離的比率增加了影響未調整和調整的存活率。然而，一個顯著的例外是淋巴細胞亞群與CD8 Treg細胞的關系。當考慮到與CD8 Treg細胞的距離時，密度與距離的比率增加時淋巴細胞的有利預后影響減弱。（圖4）
為了評估距離和密度與生存的相互關系，作者進行了多變量逐步COX回歸分析，包括所有免疫細胞密度和所有淋巴細胞亞群的距離以及年齡、分期和狀態。再次，低階段和良好的表現狀態顯示了對生存的強烈影響。獨立地，高密度的 CD163和 M1巨噬細胞對預后有利。然而，不僅純密度重要，而且免疫細胞之間的距離也表現出獨立的預后影響。當CD8 Treg和B細胞,B細胞和CD4 Treg細胞距離更近的時候，生存時間更長。此外，CD8 Eff細胞與腫瘤細胞越接近，患者的生存時間就越長，特別是所有選定參數的HR最低時。M1和M2之間距離更近時，生存更差。（圖5）
總之，這些結果表明，免疫細胞的密度和位置都具有預后信息，并且在生物標志物研究中應考慮這兩個特征。
小結
本文邏輯清晰，逐步分析得分析揭示了和預后相關的信息。首先本文開發了一個管道，這個管道可以量化免疫細胞以及免疫細胞空間位置，并設計標記基因來識別不同類型的免疫細胞。本文最大的亮點在于研究腫瘤和腫瘤基質的免疫細胞的豐度，以及豐度對癌癥預后的影響，免疫細胞和腫瘤之間的距離以及距離對預后的影響，并結合兩者——免疫細胞豐度和距離來預測和預后的而影響，從兩個角度以及將兩個角度結合更具有說服力，并在其它癌癥中進行研究。思路清晰，值得我們學習！！
