m6A與CAF

今天小編給大家帶來一篇剛剛發表在International Journal of Biological Sciences（IF：10.75）文章題目是Cancer-associated fibroblasts promote migration and invasion of non-small cell lung cancer cells via METTL3-mediated RAC3 m6A modification.

這篇文章主要研究了m6A修飾與CAF在轉移中的作用。研究發現CAF通過上調非小細胞肺癌細胞中m6A的修飾來促進非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲。NSCLC細胞中的甲基轉移酶METTL3介導CAFs對m6A的修飾，并受CAFs分泌的血管內皮生長因子VEGFA的調節。非小細胞肺癌細胞中的METTL3基因敲除顯著抑制了細胞的遷移和侵襲，并抑制了體內腫瘤的生長。METTL3與肺癌預后不良有關。機制研究表明，METTL3可增加RAC3 mRNA的m6A水平，增加RAC3 mRNA的穩定性和翻譯性。RAC3可能通過AKT/NF-κB途徑促進細胞遷移。

背景

肺癌是全球最致命的癌癥，肺癌的主要病理類型是非小細胞肺癌，占肺癌病例的85%。NSCLC主要包括肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)和大細胞癌。盡管近年來治療取得了進展，但肺癌的死亡率仍然很高。由于轉移是肺癌相關死亡的主要原因，因此迫切需要深入了解肺癌轉移的機制。

腫瘤微環境(TME)在腫瘤的發生、發展中起著至關重要的作用。腫瘤細胞和TME之間的相互作用可促進腫瘤的生長。癌癥相關成纖維細胞(CAF)是TME中的主要間質細胞，它們通過分泌細胞因子和外泌體刺激腫瘤進展。以前的研究還發現，CAF通過分泌KRT8和HMGB1促進肺癌細胞的轉移。

表觀遺傳修飾，已經成為各種生理和病理過程的關鍵調節因子。在各種mRNA甲基化中，m6A是最豐富的RNA修飾。m6A甲基化對RNA的命運起著重要的作用。研究表明，m6A基因的異常修飾參與了疾病的進展，m6A修飾有助于癌癥的進展。

CAF影響肺癌進展的不同機制已被揭示；然而，是否涉及m6A甲基化還沒有得到評估。在這項研究中，作者發現CAFs通過調節NSCLC細胞中m6A甲基化來促進NSCLC細胞的轉移潛能，并證明了CAFs對m6A甲基化的影響。并且確定RAC3為MetTL3的修飾靶點，RAC3通過AKT/NF-κB信號途徑刺激非小細胞肺癌細胞遷移。

結果解讀

CAF促進NSCLC細胞的生長、遷移和侵襲

為了探討CAF對非小細胞肺癌細胞的影響，從肺癌組織和癌旁組織中采集CAF和正常成纖維細胞，制備CAF-CM(條件培養液)和NF-CM(條件培養液)。作者選擇了三個非小細胞肺癌細胞系：A549細胞(腺癌)、H1299細胞(癌)和H661細胞(大細胞癌)。
實驗顯示CAF和NFs均可促進NSCLC細胞的生長，且CAF的作用強于NFS（圖1A）。并且CAF促進了NSCLC細胞的集落形成特性(圖1B，C)。腫瘤細胞的轉移潛能取決于它們的遷移和侵襲能力。采用wound healing（創傷愈合）實驗和Transwell實驗觀察NSCLC細胞的遷移和侵襲行為。由于CAF促進細胞增殖，為了排除這種對細胞遷移和侵襲的影響，用0.05μM絲裂霉素C預處理細胞，抑制細胞增殖，大約85%-90%的細胞存活。創面愈合實驗表明，CAF和NFs均能促進細胞遷移，但CAF更有效(圖1D，E)。在Transwell試驗中也觀察到了類似的結果(圖1F，G)。綜上，CAF增強了NSCLC細胞的生長和轉移潛能。

CAF增加NSCLC細胞中m6A的修飾

很多研究表明m6A的異常修飾參與了腫瘤的發生和發展，但CAF是否影響肺癌細胞中的m6A修飾尚不清楚。為了解CAF對肺癌細胞m6A修飾的影響，作者用CAF-CM和NF-CM處理NSCLC細胞。CAF和NFs均提高了NSCLC細胞中m6A的修飾水平，但CAF更為有效。(圖2A-C)。

作者進一步對CAF-CM的肺癌細胞進行了MeRIP-seq。結果顯示，CAFs顯著增加了m6A修飾共識5’-RRACH-3’基序的甲基化，導致CAFs處理細胞中m6A水平的提高(圖2D-F)。上述結果表明，CAF提高了NSCLC細胞中m6A的修飾。

METTL3在NSCLC細胞中介導m6A修飾

作者發現無論是在mRNA水平還是在蛋白質水平，CAF顯著增加了NSCLC細胞中甲基轉移酶METTL3和去甲基酶FTO和ALKBH5三種調控因子的表達水平(圖3A)。由于CAFs提高了m6A的修飾水平，因此作者更關注甲基轉移酶METTL3。為了確定METTL3在肺癌細胞m6A修飾中的作用。dot blot印跡分析顯示，當METTL3過表達時，m6A水平升高，而當METTL3被下調時，m6A水平下降，這表明METTL3將m6A修飾引入了肺癌細胞(圖3B，C)。然后，作者用CAF-CM處理METTL3基因敲除細胞。結果表明，METTL3基因敲除減弱了CAFs對m6A修飾的增強，表明CAFs通過METTL3上調了m6A修飾水平(圖3C)。

相比較正常細胞，METTL3在肺癌細胞系中高表達，當比較配對的腫瘤組織和非腫瘤組織中的METTL3水平時，METTL3水平顯著高于非腫瘤組織（圖3D，E），這表明METTL3可能促進肺癌的進展(圖3E)。為了驗證這一假設，在肺癌細胞中降低了METTL3的表達，并測量了細胞的生長、遷移和侵襲。與對照組相比，METL3基因敲除顯著抑制了細胞的增殖、遷移和侵襲(圖3F-H)。

接下來作者評估了METTL3在非小細胞肺癌患者中的臨床意義。TCGA數據顯示與健康對照組相比，METTL3在LUAD和LUSC患者中都高度表達(圖3I)。在LUAD和LUSC中，腫瘤組織中METTL3的表達水平都顯著高于正常組織；但在N0期和N1-N2期之間，METTL3的表達沒有顯著差異，表明METTL3與淋巴結轉移狀態無關，GEO數據表明METTL3高表達與肺癌患者的低生存率相關(圖3J，K)。綜上所述，METTL3通過調節m6A的修飾參與了NSCLC的進展。

CAF通過分泌VEGFA上調NSCLC細胞METTL3水平

雖然CAF增加了NSCLC細胞中m6A的水平，但CAF是如何調節NSCLC細胞中m6A水平的尚不清楚。VEGFA在腫瘤進展中起著關鍵作用。作者首先檢測了CAF和肺癌細胞釋放的VEGFA水平。ELISA結果顯示，兩種細胞分泌的VEGFA均高于肺癌細胞，其中CAF的VEGFA分泌量最高(圖4A)。為了探討VEGFA對肺癌細胞METTL3表達的影響，作者在DMEM/F12細胞中加入重組VEGFA，或在CAF-CM中加入VEGFA中和抗體，并將其用于培養肺癌細胞。添加重組VEGFA的DMEM/F12顯著增加了METTL3的表達，這與CAF-CM相似，而添加VEGFA中和抗體的CAF-CM顯著減弱了CAF-CM對METTL3表達的刺激作用（圖4B，C）。這些結果表明，CAFs通過分泌VEGFA提高了NSCLC細胞的METTL3水平。

CAF促進RAC3的m6A修飾和表達

RNA-seq數據顯示，CAFs治療組中有397個基因上調，219個基因下調(圖5A-C)。KEGG通路分析表明，差異表達基因主要集中在mTOR、AMPK、蛋白質消化吸收和藥物代謝等通路中(圖5D)。通過分析RNA-seq數據和MERIP-seq數據，作者進一步研究了在mRNA水平和m6A水平都變化的基因。我們發現了增加了mRNA表達的73個超甲基化的m6A峰，并將這些峰稱為hyper-up基因。還發現了167個hyper-down基因、37個低上調基因和15個hypo-down基因(圖5E)。

由于m6A修飾可能會增加基因表達，作者篩選了hyper-up基因，特別是可以刺激細胞生長的基因。其中RAC3基因的m6A水平和mRNA水平均增加，這與MERIP-seq和RNA-seq結果一致（圖5F，G）Western blotting結果表明，CAF上調了3種NSCLC細胞系中RAC3蛋白的表達，同時上調了METTL3的表達(圖5H)。此外，肺癌組織中的RAC3水平高于配對的癌旁組織，并在LUAD和LUSC組織中顯著上調（圖5I，J）。并RAC3水平與淋巴結轉移狀態的相關性。在LUAD中，N0-N2期腫瘤組織中RAC3水平明顯高于正常組織；同樣，LUSC中N0-N3期腫瘤組織中RAC3水平顯著高于正常組織，而N0期和N1-N2期腫瘤組織中RAC3水平無顯著差異，提示RAC3與淋巴結轉移狀態無關(圖5K)。這些結果表明CAF促進了RAC3的m6A修飾和表達，而RAC3與NSCLC的轉移無關。

METTL3增強RAC3基因m6A甲基化及其穩定性

為了評估METTL3和RAC3轉錄本之間的直接相互作用，進行了RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR檢測。與對照抗體IgG相比，METTL3特異性抗體顯著增加了RAC3的mRNA，CAF-CM顯著增強了這種結合（圖6A）。MeRIP-qPCR結果進一步表明，METTL3過表達顯著增加了RAC3 mRNA中m6A的修飾。而當METTL3在肺癌細胞中被敲除時，CAFs對m6A修飾的增加被減弱(圖6B)。

METTL3基因敲除降低了RAC3的mRNA水平，而METTL3過表達則增加了RAC3的轉錄。用CAF-CM處理METTL3基因敲除細胞。當METTL3減少時，CAF對RAC3轉錄的刺激作用被阻斷（圖6C）。

此外，我們通過用放線菌素D處理細胞來研究METTL3對RAC3 mRNA穩定性的影響。RAC3 mRNA的表達最初被降低；METTL3的沉默加速了mRNA的衰退，而強制表達METTL3則逆轉了這些影響(圖6D)。此外，在蛋白質水平上，METTL3基因的敲除顯著降低了RAC3的蛋白質水平；相反，METTL3的過表達顯著增加了RAC3的蛋白質水平(圖6E)。CAF增加了RAC3的表達；然而，當METTL3被下調時，這種影響被緩解(圖6E)。這說明METTL3甲基化了RAC3 mRNA，并通過防止降解來維持其穩定性，這導致了RAC3表達的增加。CAF以CAF-METTL3-m6A修飾依賴的方式增加RAC3的表達。

CAF通過RAC3介導的AKT/NF-κB途徑促進非小細胞肺癌細胞遷移

CAF-CM使p-AKT和p-P65水平升高，而總AKT和P65水平不變（圖7A）。當METTL3被敲除時，CAF-CM對AKT/NF-κB通路沒有影響。當AKT抑制劑Perifosine或NF-κB抑制劑JSH23預處理細胞時，CAF對細胞遷移的促進作用顯著減弱，METTL3基因敲除減弱了CAF的促進作用(圖7B)。

已有研究表明RAC3參與了腫瘤的侵襲和轉移。當RAC3在肺癌細胞中被敲除時，CAF促進的遷移作用減弱。相反，當RAC3在肺癌細胞中過表達時，CAF促進了遷移(圖7C)。RAC3的沉默抑制了CAF對AKT/NF-κB通路的激活，而RAC3的過表達則增強了AKT/NF-κB通路的激活（圖7D）。

抑制METTL3減弱CAFs對肺癌體內生長的影響

作者首先通過慢病毒感染建立了穩定的METTL3基因敲除細胞系A549-METTL3-KD。并通過Western blotting檢測METTL3基因敲除的效率(圖8A，B)。評估METTL3在細胞生長中的作用。如所示，肺癌細胞中METTL3表達的減少顯著抑制了細胞的生長、遷移和侵襲（圖8C-E）。

接下來，作者將小鼠分為A549細胞組、A549細胞+CAFs組、A549-METTL3-KD細胞組和A549-METTL3-KD細胞+CAFs組。CAF顯著刺激腫瘤生長。有趣的是，我們觀察到A549-METTL3-KD細胞不形成腫瘤。這與我們的體外研究一致，該研究表明METTL3抑制抑制了肺癌細胞的生長（圖8F，G）。值得注意的是，當肺癌細胞中的METTL3被敲除時，CAF對腫瘤生長的刺激作用顯著減弱。

此外，作者利用腫瘤組織研究了其潛在的機制。免疫組織化學分析顯示，CAFs可增加腫瘤組織中METTL3和RAC3的表達(圖8H)。dot blot分析顯示，CAF顯著增加腫瘤組織中m6A的水平；然而，METTL3基因敲除取消了這一作用(圖8I)。此外，CAF上調了轉移相關基因MMP9和Twist1，上調了RAC3，并激活了AKT(圖8J)。這些發現與我們的體外研究結果一致，提示CAF通過METTL3介導的m6A修飾RAC3 mRNA，并激活轉移相關基因和AKT途徑，促進肺癌生長。

總結

作者研究表明CAF通過依賴m6A修飾的調控機制促進NSCLC細胞的轉移潛能，而METTL3在NSCLC細胞中介導m6A修飾。進一步確定RAC3是METTL3的下游靶點，RAC3通過AKT/NF-κB途徑促進非小細胞肺癌細胞的遷移，提示RAC3 m6A修飾可能成為肺癌治療的潛在治療靶點(圖8K)。