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人類和癌癥斗爭也有好幾百年的歷史了，但是無論醫療科學技術如何進步，我們似乎從來都無法根除這種疾病。不同于其它類型的疾病，腫瘤細胞有超常的適應能力，它們可以通過不斷產生新的克隆型去不斷適應新環境，這就導致我們始終無法通過某一種“特效藥”去消滅所有的腫瘤細胞。在21世紀之前的以腫瘤生物學為導向的科研成果被證實都無法有效的控制腫瘤生長，因為我們即使已經知道了當下腫瘤細胞的突變景觀，但是卻永遠無法預測它們接下來會有什么樣的突變。隨著對腫瘤研究的不斷深入，科學家發現以往的“以靜制動”為主導的治療理念對腫瘤的效果是非常有限的，應當轉變理念達到“以動制動”。因此，就在對腫瘤治療研究一籌莫展的時候，有科學家率先提出可以調動機體的免疫系統去殺傷腫瘤，即是利用免疫細胞強大的動態監視功能去控制腫瘤，達到及時發現并殺傷新的腫瘤細胞突變體，使其在可控范圍內。
在眾多以免疫為主導的治療中，免疫檢查點封閉治療(ICB)的療效是最顯著的，相應的研究成果也獲得了2018年諾貝爾生理或醫學獎。眾所周知，ICB的臨床反應被認為主要是由T細胞識別新抗原所介導的，這些新抗原來源于癌癥特異性突變，并呈現在主要組織相容性復合體分子(MHC)上。之前的研究主要集中在MHC-I類分子限制CD8+細胞毒性T細胞上，主要描述了人類腫瘤中T細胞的抗原特異性和轉錄狀態。最新的研究則表明，針對MHC-II類的致癌驅動突變也在癌癥患者中被發現，因此針對新抗原的CD4+T細胞也應當被重視起來，并且新抗原特異性CD4+ T細胞在人類癌癥免疫中發揮重要作用。
但即使是對腫瘤治療效果較好的ICB，近些年也不斷被發現有很多短板，最主要的問題之一就是在不同患者身上呈現的應答率明顯不同。由于ICB治療過程花費巨大，而且一旦沒有療效就會影響患者的有效治療窗口，因此我們迫切需要良好的生物學標志物提前預測有哪些患者將會在ICB治療后獲益。同時，有關為何有些患者對ICB治療無應答的主要原因，其中主要還是我們對腫瘤微環境的認識不夠深入，特別是對T細胞的研究還不夠透徹。于是近些年，特別是在單細胞測序技術大量的運用在腫瘤微環境的研究之后，不斷有新的T細胞亞群，以及重要的功能基因被鑒定出來，其中一個就是我們今天要說的主角--CXCL13+ T細胞。下面，Immugent將會通過近些年圍繞CXCL13+ T細胞的研究成果，系統的分析這群重要的T細胞亞群在腫瘤微環境中的作用。
1. 首次提出T細胞上表達CXCL13具有重要功能
腫瘤浸潤T細胞表達CXCL13首次進入科學家的視野是在2019年發表的一篇Cell上，篇名為：“Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma”。這項研究的作者通過對25個黑素瘤患者的腫瘤內免疫細胞進行了單細胞轉錄組和TCR測序，并且提出通過metacell算法降低單細胞測序深度淺的影響。隨后，作者對所有CD8T細胞構建metacells，并進行基因表達分析，并且作者成功鑒定出了在不同T細胞亞群上一些共表達的基因模塊。這些基因模塊包括與細胞毒性效應功能相關（GZMH，GNLY，FGFBP2和CX3CR1），或者與功能失調狀態相關（TIGIT，PD-1，LAG3和CXCL13）。因此，CXCL13在T細胞中的作用首次被凸顯出來，并且是作為T細胞的衰竭性marker。
圖1：
通過相關性分析，作者證明了細胞毒性和功能失調的兩個基因模塊之前是呈負相關的。基于這些數據，他們計算了兩個數值，一個量化功能失調基因模塊的活性（基因模塊錨定于LAG3），另一個評估細胞毒性基因模塊表達的總體強度（基因模塊錨定于FGFBP2）。然后，他們對所有CD8 metacells的“細胞毒性”數值和“功能失調“數值的分布進行比較，觀察到“過渡性”CD8T細胞與功能失調的T細胞是連續分布的。相反的，細胞毒性T細胞和“過渡態” CD8T細胞之間或其與功能失調T細胞之間的連續性很弱。如下圖J所示，CXCL13作為功能衰竭性相對于Na?ve T細胞上調的基因再次被富集出來。
圖2：
在這項研究中，雖然作者發現了CXCL13在衰竭性T細胞上特異性高表達，但是由于作者的重點是在全局層面揭示影響功能衰竭性T細胞分化的因素。同時，他們的數據主要揭示了功能失調的CD8+ T細胞在腫瘤微環境中處于動態分化和高度活躍的狀態，而且很可能驅動著腫瘤特異性免疫應答。因此，這項研究的結果會有導向性使后續研究者將CXCL13作為T細胞衰竭性功能分子去研究，這在后續研究中被證實是不準確的。可能是metacell的算法的使用，掩蓋了CXCL13+ T細胞作為一個獨立的亞群所存在，但是也正是因為metacell的提出，大大的提高了不同T細胞亞群間的差異基因，讓研究者發現了這個重要分子。
2. CXCL13可塑造免疫活性腫瘤微環境并增強 PD-1療效
T細胞上表達CXCL13分子再次進入研究者的視野是在2021年國人發表在JITC雜志上的一篇文章，篇名為“CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer”。臨床研究表明大多數高級別漿液性卵巢癌 (HGSC) 患者對免疫檢查點封鎖缺乏有效反應，但是具體原因仍然有待研究。由于濾泡細胞毒性 CXCR5+ CD8+ T 細胞通過腫瘤中的免疫檢查點阻斷來恢復活力，在這項研究中作者發現腫瘤中升高的CXCL13表達表明存在更具免疫活性的微環境，并傾向于能夠有效延長患者的生存時間。
圖3：
此外，作者發現CXCL13在體內與 CXCR5+ CD8+ T 細胞相鄰，并在體外促進 CXCR5+ CD8+ T 細胞的募集和激活。CXCL13、CD8和CXCR5的組合被證實是HGSC 患者OS和PFS的獨立預后因素。將 CXCL13與 PD-1阻斷療法相結合可增強抗腫瘤反應并延緩腫瘤生長，并且CXCL13 通過促進TLS 中CXCR5+ CD8+ T 細胞的維持來塑造抗腫瘤微環境的關鍵作用。因此，CXCL13和 CXCR5+ CD8+ T細胞可能為免疫檢查點阻斷治療的潛在預后指標或反應生物標志物。
3. 腫瘤抗原特異性CD4+ T細胞表達CXCL13
在過去很長的一段時間內，對殺傷腫瘤T細胞的研究主要集中在MHC-I類分子限制性的CD8+細胞毒性T細胞上，前期的結果也主要描述了人類腫瘤中CD8+ T細胞的抗原特異性和轉錄狀態。今年發表在Cancer cell 雜志上的一篇名為：Neoantigen-specific CD4+T cells in human melanoma have diverse differentiation states and correlate with CD8+ T cell, macrophage, and B cell function，則是針對新抗原的CD4+ T細胞，包括MHC-II類的致癌驅動突變，也在癌癥患者中被發現。在這項研究中作者發現，新抗原特異性CD4+ T細胞在人類癌癥免疫中發揮重要作用，而且CXCL13是作為這群T細胞的標志性marker。
圖4：
為了更準確的揭示不同腫瘤浸潤CD4+ T細胞亞群的功能，作者使用流式分選出CD3+ CD4+ T細胞，并進行了scRNA和TRC VDJ重排測序。通過嚴格的數據篩選后，共有10186個腫瘤浸潤性CD4+T細胞被保留，隨后的無監督聚類得到6個細胞群，包括1個FOXP3+ Treg（cluster 0），3個PD-1+ CXCL13+經典T細胞(cluster 2，3，5)，以及2個IL7Rhigh CXCL13- TCONV（cluster1，4）。其中，作者共鑒定出259個細胞，平均每個患者17-146個細胞，會表達40種新抗原特異性的TCR克隆型。值得注意的是，CXCL13+ T簇中含有97%的新抗原特異的T細胞和99%的自體抗原特異性T細胞，而9個病毒特異性T細胞都在CXCL13-T細胞中，4例患者中有3例共91個細胞均顯示CXCL13特異性高表達。在這4例患者中，總共有8.8%的CXCL13+ PD-1high腫瘤浸潤CD4+細胞亞群表達了經鑒定為腫瘤特異性的TCR。
在20例黑色素瘤患者的隊列中，作者發現CXCL13+ CD4+ T細胞和CD8+T細胞相關，尤其是更緊密地與CXCL13+ CD8+ T細胞和增殖TYMS+ CXCL13+ CD8+ T細胞相關。同時，使用CXCL13、BTLA和IL21的表達作為CXCL13+ CD4+ T細胞的替代，對TCGA數據進行了分析。這些標記物均與黑色素瘤中CD8A的表達相關。總之，具有腫瘤抗原特異性的CD4+T細胞的比例與CD8+ T細胞的浸潤和活化有關，這與CD4+ T細胞為腫瘤抗原特異性CD8+ T細胞提供輔助功能是一致的。
圖5：
為了證實CXCL13+ CD4+ T細胞是普遍存在的，作者分析了另一套來源于接受ICB治療的乳腺癌單細胞數據。通過分析已經發表的乳腺癌數據，作者發現類似的CD4+ T細胞群體同樣存在于乳腺癌患者中，在這套數據作者同樣證實CXCL13+ CD4+ T細胞的比例與TME的CD8+ T細胞、髓系細胞和B細胞組分的激活相關。最后，在TCGA中廣泛觀察癌癥類型，CXCL13表達歸一化到CD4表達中位數以上與皮膚黑色素瘤、乳腺癌和頭頸癌總生存率較高相關，但在膠質母細胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、乳頭狀和透明細胞腎癌中生存率較差相關。因此，泛癌分析的結果表明CXCL13可能在不同的腫瘤環境中可能呈現不同的功能，其實際上可能和CXCL13+ CD4+ T細胞調節的細胞功能相關。
4. CXCL13+T細胞與樹突狀細胞的相互作用決定免疫治療效果
同樣是今年，在Nature Cancer雜志上發表了另一篇一篇名為“The interaction of CD4+ helper T cells with dendritic cells shapes the tumor microenvironment and immune checkpoint blockade response”的文章，首次證實了CXCL13+ T細胞可以通過和樹突細胞（DC）相互作用來發揮重要的抗腫瘤功能。這項研究的作者通過單細胞測序技術對人非小細胞肺癌進行分析，詳細描述了CXCL13+ CD4+ T細胞與樹突狀細胞的相互作用，并且作者在體外和卵清蛋白特異性αβTCR CD4+T-t細胞模型中重建了它們的相互作用。最終，作者證明了Tht程序（CD4+ PD-1+ CXCL13+ T細胞介導）由層遞腫瘤抗原的DC在腫瘤淋巴結中啟動，這種程序對于利用抗PD-1治療的抗腫瘤反應非常重要。
圖6：
為了表征和分子分析TME中髓系細胞和T細胞之間的物理相互作用，作者將PIC-seq（這項技術的介紹見之前推文：PIC-seq：單細胞層面揭示存在物理作用的細胞互作）技術應用于早期非小細胞肺癌(NSCLC)病變的臨床樣本進行分析。作者分析了10例患者通過手術切除的早期未接受治療的NSCLC病變，并將腫瘤參與的病變與鄰近的無腫瘤組織進行了比較，使用MetaCell創建了TME和健康組織中單細胞狀態的背景模型。根據基因表達將T細胞進行分類：遷移T細胞，幼稚T細胞，增殖T細胞，CD4+激活T細胞，CD4+記憶T細胞，CD8+T細胞，CD8+細胞毒性T和CD8+功能失調T細胞。隨后，作者同樣根據VCAN或CD31基因將骨髓細胞分為單核細胞的兩個子集，并且將其他髓系亞群分類為四組樹突狀細胞：表達DC的單核細胞基因、經典DCI型樹突狀細胞、經典DCII型細胞和富含免疫調節分子的成熟樹突狀細胞。作者發現腫瘤組織和鄰近無腫瘤組織之間的細胞組成存在一致的差異，他們計算了每個標本的TME與健康細胞狀態的比率，并量化了子集豐度之間的相關性。結果與之前對NSCLC病變的的單細胞分析一致，因此這個結果可以作為研究TME中定義細胞相互作用的分子程序的基線。
圖7：
緊接著，為了更好地了解mTht細胞在體內的時空分化動態，作者利用小鼠模型，將B16-OVA細胞移植到WTC57BL/6J受體中。在腫瘤注射后10天和17天，對從腫瘤引流淋巴結(tdLNs)和頸部周圍淋巴結(cLNs)中分離的12154個陽性單TCRβ+T細胞進行MARS-seq檢測，結果發現，抗原特異性的CD45.1+ TCRβ+ OT-IIT細胞上調了從體外研究中衍生的mTht細胞特征、tdLNCD45.1+ TCRβ+ OT-IIT細胞上調了T細胞激活特征、體內mTht細胞特征與幼稚t細胞基因的表達減少相關，并與細胞周期基因的表達相關。接下來，作者探討了mTht細胞的細胞動力學及其從tdln向TME遷移的可能性。他們收集并分析了內源性TCRβ+ T細胞，并在第10和17天從TME過繼轉移OT-II CD45.1+ TCRβ+ T細胞，以及在腫瘤注射后第10天從tdLNs和clns的細胞。結果表明，與腫瘤浸潤的T細胞上調mtht相關的激活程序。
總的來說，這項研究的作者利用PIC-seq系統地描述了CD4+T細胞與樹突細胞的相互作用對腫瘤微環境的影響，并發現PD-1+ CXCL13+ CD4+ T細胞是人非小細胞肺癌腫瘤微環境中與抗原提呈細胞的主要相互作用樞紐。并且作者通過體外模型驗證了這個相互作用中樞的功能對于利用抗PD-1治療的抗腫瘤反應非常重要，這些研究結果提示我們可以通過對Tht-樹突狀細胞相互作用檢查點的調節來進行免疫治療。
5.腫瘤特異的CXCL13+ T細胞可預測免疫治療療效
如果說上面幾項研究是從不同的角度去揭示CXCL13+ T細胞在腫瘤微環境中的作用，都得到了一定的研究成果。那么真正意義上把CXCL13+ T細胞推廣出去的是張澤民老師課題組在今年發表的一篇純生信的Nature cancer上的這篇文章，篇名為：Single-cell meta-analyses reveal responses of tumor-reactive CXCL13+ T cells to immune-checkpoint blockade。在這項研究中，作者分別對已發表的9個免疫治療單細胞數據集，其中包括來自102個病人治療前后的205個腫瘤樣本，涵蓋5種癌癥類型（NSCLC, BCC, SCC, breast cancer 和 RCC）進行聯合分析。最終，作者基于CXCL1的表達鑒定出了這些數據集中的腫瘤特異CD8+ T細胞，發現腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞顯著富集在對ICB有響應的腫瘤中，并且在有效地治療后顯著增加，表明了腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞在治療過程中發揮關鍵作用，且在治療前的浸潤程度可以預測ICB的療效。
圖8：
通過對腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞進行聚類分析，作者鑒定了前體腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞（包括IL7R+ HAVCR2-以及GZMK+ HAVCR2-兩個亞型）以及耗竭信號較強的終末分化腫瘤特異T細胞，并且發現腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞不同分化狀態亞型在表觀特征上是穩定的。此外，作者還發現了在不同癌癥類型中以及治療策略不同時（例如是否與化療聯用），治療引起增加的腫瘤特異T細胞的亞類是不一樣的。當腫瘤微環境整體免疫抑制強度較高時，ICB不足以維持前體腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞的狀態，觀察到終末分化的腫瘤特異T細胞增加，但治療仍然有效。當腫瘤微環境整體免疫抑制強度較低時，ICB有效阻斷了腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞前體細胞向耗竭程度較高的終末狀態的分化。
圖9：
通過這項研究，作者不僅為分析腫瘤中的腫瘤特異T細胞提供了新的思路，為預測ICB療效提供了更加準確的生物標志物；而且，還設計以TCR-T為代表的細胞療法提供了新的策略，即通過CXCL13表達水平鑒定腫瘤中不同分化階段的腫瘤特異T細胞克隆并設計后續臨床試驗；最后，為進一步提高ICB療效提供了新的見解，即通過ICB與其他療法聯合治療進一步緩解腫瘤微環境中的免疫抑制強度，維持前體腫瘤特異性CXCL13+ CD8+ T細胞狀態并阻斷其向終末狀態分化，進而繼續提高治療效果。
6.展望
通過對上面幾篇有關CXCL13+ T細胞高分文章的聯合解讀，我們僅僅是對這種T細胞亞群有了一個大致的了解，它的具體功能仍然有很多不清楚的地方。比如，CXCL13分子最初被提出時是作為T細胞功能衰竭的marker（Cell,2019），而隨后就被發現可以被用作免疫治療應答與否的標志物（JITC, 2021）；緊接著，今年的幾篇研究都將CXCL13+的CD4 T細胞作為腫瘤抗原特異性的T細胞（Cancer cell），以及在多種腫瘤中都可以作為免疫治療應答的標志物（Nature cancer）。盡管看似我們已經對CXCL13+ T細胞已經有一個全面的認識，事實上還有很多問題沒有解決，如：哪一種轉錄因子或者通路調控了CXCL13+ T細胞的發育分化？CXCL13+ T細胞的功能靠什么維持，以及能否被逆轉？這些都是未來需要解決的問題。
雖然現如今生物科技進步迅速，但癌癥可能是人類最無法通過醫療技術根治的疾病之一了，無論是從腫瘤細胞本身的生物學特征出發還是從與之抗衡的人體免疫系統出發，這兩條路都有很長的路程要走。其實我們不用奢求將腫瘤治愈，只需要控制其進展以達到類似于高血壓這種慢性病程度即可。而要想實現這個目標我們迫切需要更全面的認識人體免疫系統，因為就像神經系統一樣，免疫系統的功能十分強大，其可以通過協調各種免疫分子的細胞來達到動態監控腫瘤的作用。但想攻破人體復雜的免疫系統是非常艱難的，就拿腫瘤微環境中的T細胞來說，近5年就將有20+種不同的T細胞亞群被發現，還有其它很多復雜的免疫分子，如細胞因子，補體等。但Immugent始終堅信未來在全球免疫學家的共同努力下，我們終將會對免疫系統有一個更加清晰的認識，到那時我們就可以充分調動人體的免疫系統去控制腫瘤生長。
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