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大家好，今天又帶來一篇11月最新見刊的癌癥分型結合免疫微環境文章，還和免疫檢查點抑制劑關聯，可見這個方向有多熱了，肝細胞膽管癌(cHCC-CCA)是一種罕見的原發性肝癌，預后不良。研究人員確定了兩種主要的免疫亞型cHCC-CCA(免疫高和免疫低)。被分類為免疫高(immune - high)的腫瘤表現出與適應性、先天免疫、抗原呈遞、細胞毒性、免疫抑制和炎癥相關的基因過表達。它們還與提高總生存率和顯示激活的基因signature有關，這些基因signature最近被證明與肝癌患者抗pd1阻斷抗體的反應有關。研究人員的結果可能對未來使用免疫調節劑的臨床試驗設計和對這種高度侵襲性惡性腫瘤患者的分層具有重要意義。
肝細胞膽管癌(cHCC-CCA)是一種罕見的惡性腫瘤，預后不良。研究人員的目的是調查cHCC-CCA的免疫概況，并確定其對疾病結局的影響。
研究人員對96例cHCC-CCA患者進行了一項多中心研究。使用nCounter PanCancer IO 360面板分析基因表達譜。
通過聚類分析確定了兩種主要的免疫亞型:“免疫高”(IH)亞型(57%的病例)和“免疫低”(IL)亞型(43%的病例)。IH類腫瘤表現出與免疫細胞募集、適應性免疫和先天免疫、抗原呈遞、細胞毒性、免疫抑制和炎癥相關的基因過表達。IH cHCC-CCAs也顯示了基因標記的激活，最近表明與肝癌患者免疫治療反應相關。免疫染色定量證實IH腫瘤的特點是免疫細胞密度較高。免疫亞型與任何基因改變無關。最后，多因素分析顯示IH亞型是改善總生存率的獨立預測因子。
研究人員已經確定了一個cHCC-CCA的亞組，顯示了持續的腫瘤內免疫應答的特征，同時激活了預測肝癌免疫治療應答的基因特征。該腫瘤亞型與改善的臨床結果相關。這些發現表明，一部分慢性腎臟病-慢性腎臟病患者可能受益于免疫調節治療方法。
研究人員納入了5所大學醫院，
納入標準如下:
可用基線數據和組織學資料，
明確的組織學特征，
術前抗腫瘤治療不足。
系統記錄了下列臨床和生物學特征:年齡、性別、肝病病因(乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)感染、酒精攝入和代謝綜合征)、隨訪(總生存期)、血清甲胎蛋白水平、腫瘤大小、多結節性、衛星結節、血管侵犯(大血管/微血管)和手術邊緣。
使用METAVIR評分評估非腫瘤肝纖維化(F0:無纖維化，F1:無隔膜的門脈纖維化，F2:有少量隔膜的門脈纖維化，F3:有很多隔膜的門脈纖維化，F4:肝硬化)。共有96例患者符合研究人員的納入標準。他們主要是男性(73%)，手術時的中位年齡為59歲。主要的潛在病因是酒精攝入(n= 3745%)、HCV感染(n= 22,24%)、HBV感染(n= 20,22%)和非酒精性脂肪肝炎(n= 11,14%)。50%(27/54)的患者發現術前AFP水平高(20 ng/ml)。一部分患者患有多結節性疾病(n= 23,24%)。絕大多數腫瘤發生在顯著纖維化的背景下(METAVIR分期F2-F3或F4, n= 80,83%)(表1)。病變的主要組織學類型為肝細胞型、膽道型和模糊型，分別占43%、25%和27%。
慢性病毒性肝炎肝組織炎癥壞死的分級和纖維化程度的分期，推薦采用國際上常用的METAVIR評分系統。簡單地說，METAVIR評分是確定肝臟炎癥壞死等級和纖維化程度的測試。
肝纖維化可能導致肝硬化，是慢性肝病的標志。因此，醫生需要評估任何慢性肝病患者中纖維化的存在和分期。血液檢查在評估肝纖維化程度的能力方面有限，肝活檢是評估肝臟肝纖維化程度的最優方法。
METAVIR評分為解讀肝活檢提供了一個模型。行肝活檢時，醫生需要一種可靠的方法來量化在顯微鏡下顯示的內容。METAVIR評分系統包含兩組標準化的數字：一個代表肝組織炎癥活動的程度；一個表示肝纖維化的程度。
METAVIR評分系統將肝纖維化程度分為0到4五個等級，將肝組織炎癥活動度（具體而言，壞死性炎癥損傷的強度）分為A0到A3四個等級。
METAVIR評分系統——肝組織纖維化分期評分：
? F0=無纖維化
? F1 =匯管區纖維性擴大，但無纖維間隔形成
? F2=匯管區纖維性擴大，少數纖維間隔形成
? F3=多數纖維間隔形成，無硬化結節
? F4=肝硬化
METAVIR評分系統——肝組織炎癥活動度評分：
? A0 =沒有活動
? A1 =輕度活動
? A2 =中等活動
? A3 =重度活動
METAVIR評分是醫生可以使用的眾多評估“工具”之一，以幫助確定患者的治療和監測疾病的進展。2分及以上得分提示應該開始治療。但情況并非總是如此，因為有些評分較低的個體也可能需要接受個體化治療。
與大多數評估系統一樣，METAVIR系統的優點和缺點并存。其他評分系統是可獲得的，例如Knodell評分（也稱為組織學活性指數或HAI）。但是，METAVIR評分系統容易使用。
其他不需要進行肝活檢的評估纖維化的方法正在研究中，但在目前，肝活檢仍是評估纖維化程度的金標準。
盡管METAVIR評分可以作為確定是否以及何時開始治療丙型肝炎的有效評估手段，但也存在一定的局限性。具有相同METAVIR評分的不同個體可能存在不同的情況，并且治療需要個體化而不是單獨依靠評分來選擇治療。
METAVIR評分也受到肝活檢質量的影響。小的活檢標本可能無法獲得可以代表整體肝臟的評分。METAVIR評分僅來源于肝臟的某一個區域，在肝臟的不同區域也可能存在顯著的異質性或炎癥和纖維化的變異性。這樣，評分可能高估或低估存在的炎癥或纖維化的數量。
一般來說，了解纖維化階段對指導治療決策是有價值的。例如，纖維化程度可以提示治療應答的可能性。此外，如果纖維化進展緩慢，最好在開始抗病毒治療之前等待。
研究人員通過無監督分層聚類分析研究了所有96例cHCC-CCA樣本的基因表達譜，并確定了兩種不同的cHCC-CCA免疫亞型，研究人員將其命名為免疫低(IL)和免疫高(IH)(圖1A)。分類為IH的腫瘤占57% (n=55)。IH 亞型中顯著上調的基因包括細胞因子/趨化因子及其受體(如IFNG、CCL19、CXCL9、IL1B、IL2、IL33、IL4、IL10、IFNA1、CXCR3)、各種免疫細胞亞群的標記物(如CD8A、CD79A、CD19、KIR2DL3、CD209、FOXP3、KLRK1、KLRD1)、免疫調節劑(如PDL1、IDO1、LAG3、TIGIT、CTLA4)、細胞溶解效應物(如PRF1, GZMB, GZMM)，人類白細胞抗原系統成分(如HLA-A, HLA-DRB1, HLA-RB5)和癌癥睪丸相關抗原(如MAGEA1, MAGEA4)(圖1B)。
IH亞型與手術類型(移植，p=0.05)、相鄰肝內肝硬化的存在(p=0.01)、較低的微血管侵犯頻率(p=0.01)、和肝細胞的優勢(p=0.005)(補充表2)。雖然無監督分層聚類顯示了兩個主要的cHCC-CCA亞類，但研究人員觀察到一定程度的聚類內異質性，在IH腫瘤中發現了兩個亞組:子集群IH1(主集群的左側)和子集群IH2(主集群的右側)(圖1A)。IH1病例約占所有IH cHCC-CCA的一半(n 26/55, 47%)，與亞群IH2相比，顯示先天免疫和NK細胞相關基因的過表達(IFNA1, KIR3DL2, KIR2DL3，KIR3DL1)。IL1(主IL簇左側)和IL2(主IL簇右側)子簇之間的比較顯示癌睪丸抗原。然而，進一步了解這種異質性將需要研究更多的病例。
為了比較cHCC-CCA與常規HCC和CCA的免疫譜，研究人員進一步對來自TCGA的兩個獨立數據集(TCGA- LIHC n=355和TCGA-CHOL n=36)進行了整合轉錄組分析，結果顯示，cHCC-CCA保留了它們的免疫類別，并聚集在HCC和CCA附近，具有類似的轉錄組特征(補充圖2)。
然后，研究人員的目標是在20例cHCC-CCA(33)的公共數據集上驗證研究人員的發現。在研究人員的系列中觀察到，無監督層次聚類也顯示了2個主要的免疫聚類(高和低)，(補充圖3)。研究人員觀察到參與各種免疫過程(如適應性免疫或抗原處理)的基因的免疫高亞群上調，由于該數據集病例數量較少，在多次檢測調整后，只有9個基因差異仍然顯著)。與IH2相比，IH1簇顯示出NK細胞相關基因上調的趨勢，正如研究人員的系列研究中發現的那樣。研究人員還觀察到IL1和IL2之間癌癥睪丸抗原基因失調的趨勢，由于病例數量非常少，在多次測試校正后，差異沒有顯著性)。總之，這些觀察加強了研究人員在一系列腫瘤中所獲得的結果。
為了更好地了解IH腫瘤的生物學，研究人員選擇并注釋了一系列與主要免疫通路相關的161個基因(圖2)。研究人員發現，基因簽名與免疫細胞募集、適應性和先天免疫、抗原處理和呈遞、IH cHCC-CCA亞型對癌細胞的細胞毒性/殺傷、免疫抑制和調節以及炎癥均有上調(圖2)。然而，各組中兩個亞群對這些通路的激活沒有差異。盡管如此，這些亞群顯示了參與細胞增殖的不同基因調控(IL1與IL2, p=0.003;IH1與IH2, p=0.004)。
研究人員還通過兩種不同的方法:基因表達譜分析和免疫組織化學染色數字圖像分析來證實IH腫瘤中免疫浸潤增加。研究人員第一次表明,T細胞相關基因集,CD8 T細胞,B細胞,疲憊的CD8 T細胞,巨噬細胞,樹突細胞,中性粒細胞和NK細胞在IH cHCC-CCA調節(圖3)。與上述集群內異質性一致，研究人員觀察到一些IH cHCC-CCA缺乏特定的免疫細胞亞群，如B細胞、中性粒細胞或NK細胞(圖3A)。
研究人員進一步隨機選取67例患者，對其主要免疫細胞亞群進行免疫組化染色，并用Qupath軟件對掃描的數字切片進行密度量化。通過基因表達譜分析得到的結果表明，在IH腫瘤中，CD3+ T細胞、CD8+ T細胞、CD20+ B細胞和CD68+巨噬細胞的腫瘤內密度較高(圖3B和3C)。mRNA表達水平與免疫組織化學之間的相關性見補充圖5。MPO+細胞密度有增加的趨勢，但沒有達到統計學意義(圖3B)。鑒于IH亞型與HCC組織學組優勢之間的相關性，研究人員對30例HCC中每個組的原位免疫浸潤進行了量化，但未檢測到任何顯著差異(補充圖6)。
研究人員最終對96例患者的腫瘤組織中三級淋巴樣結構(TLS)進行了量化。根據研究人員的基因表達和免疫組化結果，研究人員觀察到在IH腫瘤中TLS密度顯著升高。
最近的一項研究表明，在使用抗pd -1單克隆抗體nivolumab治療的晚期HCC患者中，幾個基因特征是相關的，可改善臨床結果。因此，研究人員的目的是確定屬于IH類的cHCC-CCA是否顯示了與總生存率和/或客觀緩解率顯著相關的基因集的上調。
研究人員觀察到IH腫瘤的特征是所有這些基因的顯著過表達:6-Gene Interferon Gamma簽名,Gajewski 13-Gene炎癥簽名,Sangro炎癥簽名和T細胞衰竭簽名(圖4A)。它們明顯包括各種細胞因子/趨化因子(CXCL10, CXCL9, CCL4, CCL2)，免疫衰竭/檢查點抑制劑(PDL1/CD274, LAG3, PDL2/PDCD1LG2, IDO1)和HLA系統的組成部分(HLA- dma, HLA- dmb, HLA- doa, HLADOB)。最后，由于PDL1也被認為是免疫治療應答的標志，研究人員也評估了其在50例隨機選擇的腫瘤和免疫細胞上的表達，但沒有觀察到樣本的免疫亞型有任何差異(補充圖8)。
研究人員還研究了研究人員的免疫組與以前報道的HCC免疫級別的基因標記的關系;在該簽名的110個基因中，研究人員的面板中有33個基因可用(圖4A)。正如預期的那樣，研究人員的IH組顯示了這些基因的強過表達(圖4A)。研究人員進一步的目的是確定研究人員的子組是否與活躍的或耗盡的子類型相關。研究人員比較了不同亞類(CD8A、CD3E、CD3G、IFNG、PRF1、CXCL9、CXCL10、TBX21、CXCL12、CCL2)關鍵基因的表達差異。除了IH2中CXCL12的表達高于IH1外，在研究人員的1)IH1和IH2亞組以及2)IL1和IL2亞組之間沒有差異表達，這表明研究人員的亞組與HCC的這些免疫亞組不一致(補充圖9)。
利用目標下一代測序，研究人員進一步篩選了隨機選擇的45個樣本，以檢測據報道在cHCC-CCA中經常發生的分子改變。調查樣本中IH亞類29例，IL亞類16例。最常見的基因缺陷是TP53突變(58%)，其次是MYC擴增(18%)，TERT啟動子(16%)，BAP1突變(9%)和FGF19擴增。這些發現與之前研究cHCC-CCA分子特征的研究一致。但沒有發現免疫亞型和分子改變之間的任何顯著關聯(圖4B)。
包括cHCC-CCA在內的plc（原發性肝癌），最常發生于可能影響抗腫瘤免疫的慢性肝病和炎癥。因此，研究人員的目的是確定腫瘤的免疫亞型是否與周圍非腫瘤實質的免疫浸潤有關。首先，研究人員隨機選取19例患者，從鄰近肝臟中提取mRNA，并使用相同的基因表達面板進行基因表達譜分析。使用主成分分析，研究人員調查了匹配的剖面之間的關系。研究人員觀察到，樣本傾向于根據其腫瘤或非腫瘤性質聚集，而不是根據獲取樣本的患者(圖5A)。主成分1和主成分2的二維表示也顯示腫瘤樣本通常位于遠離非腫瘤樣本的地方(圖5A)。研究人員進一步量化了67例進行免疫組化的患者的免疫細胞密度，并根據相鄰的cHCC-CCA的免疫亞型比較其值(圖5B)。與基因表達實驗一致，根據腫瘤的免疫亞型，研究人員沒有發現任何非腫瘤免疫細胞密度的顯著差異(圖5B)。總之，這些結果支持了cHCC-CCA亞型與鄰近肝實質的免疫浸潤無關的假設。
最后，研究人員評估了cHCC-CCA免疫亞型對預后的影響。73例患者有生存資料。未治愈性切除的患者被排除在外。有21人死亡。IH亞型患者24個月、60個月的總生存率分別為90%、80%，IL亞型患者為71%、67%。不同免疫亞型存活時間的Kaplan-Meier曲線如圖6所示。單因素分析顯示IH亞型，衛星結節，HBV感染顯著影響cHCC-CCA患者的總生存時間，死亡風險增加。多因素分析證實IH是一個獨立的預后因素。最近有研究表明，非腫瘤肝臟的免疫浸潤可能影響HCC的預后，研究人員也評估了這種情況是否也可能發生在cHCC-CCA中。然而，研究人員沒有觀察到生存率與CD3+ T細胞、CD8+ T細胞、CD20+ B細胞、CD68+巨噬細胞和MPO+細胞密度之間的任何顯著關聯(補充圖10)。
本研究中表明，大約60%的cHCC-CCA屬于一個特殊的亞類，其特征是具有顯著的免疫浸潤，激活與先天免疫和適應性免疫相關的各種途徑。雖然還需要通過臨床試驗進行調查，但可以假設，這種類型的cHCC-CCA患者可能受益于免疫調節劑。事實上，在其他實體腫瘤中，免疫浸潤通常與免疫治療的敏感性增強有關，研究人員觀察到了在IH型cHCC-CCA和晚期HCC患者中，與nivolumab應答相關的幾個基因特征的富集。這部分就和當前研究熱點免疫檢查點抑制劑相結合。
同時，雖然分析顯示了兩種主要的腫瘤簇，但也在IH和IL腫瘤中觀察到了不同的亞簇。特別是，IH cHCC-CCA (IH1)的一個子集具有很高的NK細胞和先天免疫相關標記的表達。NK細胞具有良好的抗腫瘤作用，并且它們在腫瘤間質中的存在與改善各種人類惡性腫瘤的預后相關，研究得出的亞型具有更有利的臨床結果和豐富的基因特征。表明，這個研究發現可能對未來臨床試驗的設計和這種高度侵襲性惡性腫瘤患者的分層具有重要意義。
參考文獻：
Nguyen CT, Caruso S, Maillé P, Beaufrère A, Augustin J, Favre L, Pujals A, Boulagnon-Rombi C, Rhaiem R, Amaddeo G, Di Tommaso L, Luciani A, Regnault H, Brustia R, Scatton O, Charlotte F, Brocheriou I, Sommacale D, Soussan P, Leroy V, Laurent A, Le VK, Ta VT, Trinh HS, Tran TL, Gentien D, Rapinat A, Nault JC, Allaire M, Mulé S, Zucman-Rossi J, Pawlotsky JM, Tournigand C, Lafdil F, Paradis V, Calderaro J. Immune profiling of combined hepatocellular-cholangiocarcinoma reveals distinct subtypes and activation of gene signatures predictive of response to immunotherapy. Clin Cancer Res. 2021 Nov 16:clincanres.1219.2021. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-1219. Epub ahead of print. PMID: 34785581.
