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嚯，單細胞代謝！
前言
基因組學揭示了細胞的功能，轉錄組學提供了細胞的藍圖。然而，要弄清楚一個細胞到底在做什么，就需要蛋白質組學和代謝組學。正如來自歐洲分子生物學實驗室（European Molecular Biology Laboratory, EMBL）的計算生物學家Alexandrov所說：“代謝組學非常重要，它是多組學中最‘年輕’的一個，但它提供了最接近表型的圖景！”
通過單細胞代謝，我們可以最大程度上了解在給定細胞中正在發生的化學過程。即使是兩個基因序列相同的細胞，它們的代謝組也可以有很大不同。細胞和細胞外環境通過多種分子，包括代謝物等進行動態地相互作用。例如癌細胞的腫瘤微環境中充滿化學物質，阻礙免疫系統，刺激新血管的生長并引發轉移。“單細胞代謝組學非常有幫助，”在約翰霍普金斯大學（Johns Hopkins University）研究癌癥代謝的Anne Le說，“在單個患者的腫瘤中，你可以看到亞群以及確定哪些細胞正在做什么。”
動態性和復雜性
相比于基因組和轉錄組，代謝組更具有“動態性”，何為“動態性”呢？假設你對某人進行基因測序，你會發現這個人是“四分之一的法國人”，“四分之三的越南人”，你取樣本的方式不會改變這個結果。如果你把樣本放在室溫下，然后在五天內再回來，這個樣本的基因組信息仍然是一樣的，但該樣本的代謝組信息可能發生改變，代謝組不會只是坐在那里等著你。樣品制備是準確獲得樣品代謝組信息的關鍵，液氮快速冷凍是一種常見的方法。使用有機溶劑也有助于提取代謝物，例如乙腈用于基質輔助激光解吸電離質譜技術(MALDI-MS)。賓夕法尼亞州立大學（Pennsylvania State University）的 Hua Tian課題組開發了一種叫做氣體團簇離子-次級離子質譜技術(GCIB-SIMS)的方法，用冷凍水合法儲備樣品，該方法在空間和時間上“凍結”了生物系統，并提供了生物系統的最接近自然狀態的“快照”，而冷凍干燥或其他化學固定物與之相比則更容易損耗樣品的代謝信息。
除了動態性，代謝組信息還具有復雜性，代謝物有各種不同的形狀和大小，它們有數百萬種，其中僅約有5%可以從質譜數據中確定地識別出來。代謝物識別是代謝組學的基本問題之一。為了幫助從光譜結果里混亂的峰譜中梳理出具體的信息，Alexandrov的團隊創建了METASPACE（https://metaspace2020.eu/），一個基于代謝物識別算法的開放平臺知識庫，供人們共享他們的成像質譜數據。該平臺目前在全世界范圍內，約有100個實驗室在使用，其更好地幫助生物學家們理解他們手上代謝組信息的分子內容，而不需要手動瀏覽與未知分子對應的無數個光譜峰。
此外，單細胞代謝組學面臨著細胞基質的數量和細胞產物的數量缺乏線性關系的難題。轉錄組學和蛋白質組學方法可能揭示了一個細胞產生一種特定的酶，并產生了一個合理的期望——即細胞也包含由該酶作用的分子。但這些分子可能會形成中間產物或被卷入副反應，產生不可預測的新產物，還有極少數非酶催化反應，即自發反應，這些反應很難被預測。雖然代謝組學可能無法測量細胞完整的化學物含量，但提高測序通量和靈敏度的新技術正在產生大量新的生物信息。
揭秘分化
脊椎動物生命的偉大奇跡呈現在單個細胞，即受精卵，如何包含了產生數十種不同的特殊細胞類型所需的所有信息。雖然基因組通常被認為是“生命的說明書”，但受精卵的DNA不會在繁殖和分化時發生改變。在整個發育階段，基因組基本保持不變，而這些變化是由代謝組驅動的。
馬里蘭大學帕克分校（University of Maryland, College Park）的 Peter Nemes和他的團隊研發出了一種分析青蛙胚胎單個細胞代謝物的方法。在胚胎發育過程中，細胞分裂迅速，從一個較大的細胞分裂成兩個較小的細胞，大約每25小時，細胞數量翻一番，大小減半。Nemes說：“在這樣的空間和時間不斷發展的樣本中研究單細胞代謝組學是一個真正的挑戰。”首先，當胚胎處于四細胞階段時，Nemes和他的團隊使用光學顯微鏡來識別左背細胞和左腹細胞，并使用精密微毛細管，抽吸出單個細胞內容物的樣本。毛細管電泳分離代謝物，然后進行電噴霧電離和高分辨率質譜分析來識別和量化分子。而這個取樣的過程，并不會損害胚胎發育成正常蝌蚪的能力。“由于毛細管提取比傳統的解剖方法造成的損傷更小，細胞的壓力更小。”Nemes解釋道，“這使得我們可以重復取樣，而這更接近于測量細胞的真實代謝組信息，而不是經歷過氧化應激的細胞。”對同一細胞反復取樣的能力也使研究人員能夠在活的發育胚胎中，將代謝組學和蛋白質組學結合起來研究，蝌蚪發育過程中解剖結構或行為的任何變化都可能與蛋白質組和代謝組的變化相關聯。
而相比于單細胞轉錄組學，目前還沒有一種技術可以將細胞中所有代謝物的拷貝數放大數百萬倍，因此獲得足夠的敏感性亦是單細胞代謝組學的另一項挑戰。而Nemes團隊的方法在多個方面提高了檢測的靈敏度，首先毛細管電泳有效地分離樣品中的分子，產生清晰的峰。接著，他們基于人工神經網絡研發了一個名為 Trace的分析軟件來定位代謝物的離子信號，該軟件相比于其他分析軟件大大減少了假陽性結果帶來的噪音干擾。基于此方法，Nemes團隊記錄了八細胞青蛙胚胎中細胞之間代謝物組成的差異。他們已經證明，代謝物驅動干細胞分化為器官特異性細胞，而改變細胞中的代謝物可以改變該細胞的命運，通過單細胞代謝組學研究，可以將一個將分化為表皮細胞的細胞重新“編程”成神經組織細胞，反之亦然。
空間關系
檢測單個細胞的代謝組信息并保持細胞間的空間關系，將帶來更多的生物信息。一個細胞的生長微環境將影響其代謝，因此研究員們正在研發比較一群同源細胞之間的單細胞代謝組學數據的方法。
MALDI質譜分子成像技術是目前最常用的單細胞代謝分析技術之一。對于MALDI，要分析的樣品與基質混合，然后用紫外激光束照射。光束將分析物解離，將它們送入質譜儀。MALDI-MS具有小樣品制備和高通量的特點，并已成功用于揭示單細胞生物克隆群體之間的異質性，并用于發現組織樣本中罕見的細胞亞型。MALDI質譜分子成像技術可測量組織切片或含有電鍍細胞的載玻片上不同點的質譜，使研究人員能夠創建代謝物的空間地圖，然而，將代謝物豐度測出并精準對應上來源的單細胞對研究人員來說是一個挑戰。
為了解決MALDI成像的空間分辨率不夠高的問題，Alexandrov團隊開發了SpaceM，它將MALDI成像與光學顯微鏡和數字圖像處理相結合，以精確地將質譜數據與其對應的來源細胞相匹配。MALDI激光在基質中產生可見的灼燒痕跡作為標記，在進行MALDI成像之前，研究人員使用顯微鏡來捕獲細胞的相對位置、它們的熒光表型和任何其他相關信息。在使用MALDI成像收集代謝物數據后，再拍攝第二張顯微鏡圖像，顯示標記的位置，通過這些標記確定代謝物數據是從哪個細胞中收集的。而以亞細胞精度把前后圖像線性對應上是一個關鍵步驟，Alexandrov團隊在載玻片或者切片邊緣創建了一個基準，基于上千個基準的自動識別，可實現亞細胞精度的圖像對應。同時SpaceM還具有高通量檢測的特點，在單個載玻片中可以成像數千個細胞。
Alexandrov團隊與德國癌癥研究中心的 Mathias Heikenw?lder團隊的炎癥專家合作，使用SpaceM分析人類非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)這兩種脂質代謝紊亂的體外模型的肝細胞脂質組成，SpaceM顯示，大量的NAFLD細胞亞群（約四分之一）顯示出脂滴和中性脂質的積累，被確認為是與疾病相關的代謝狀態，在他們用炎癥細胞因子誘導NASH后，約93%的細胞呈現了此代謝狀態。
Alexandrov指出：“這種檢測群體中單個細胞代謝異質性的能力也可能應用于癌癥和免疫代謝，如果我們知道癌細胞如何適應它們的新陳代謝，那么我們就可以幫助免疫細胞適應新陳代謝，在腫瘤微環境中發揮功能。”在不分離組織內容的情況下，了解其中不同細胞的代謝狀態至關重要，這是生物分析的新前沿領域，這將有助于我們理解為什么一些免疫細胞可以穿透腫瘤微環境，而有些則不能。
賓夕法尼亞州立大學的 Hua Tian團隊使用的GCIB-SIMS是一種不需要特殊制備并保持細胞間空間關系的方法。GCIB-SIMS用一束高能離子束轟擊細胞，驅逐飛走的離子，并收集到質譜儀中。該技術結合了質譜的化學特異性,并擁有接近1 um的成像分辨率，小到足以成像單個細胞。與使用單原子離子束相比，使用氣體團簇離子束對生物標本造成的損害更小，可以用于檢測大質量的生物分子。Hua Tian團隊近來開發了一種基于水簇離子束和碳簇離子束相結合的次級離子質譜分析法，水簇光束在不破壞樣品的情況下檢測代謝產物，細胞用鑭系標記的抗體標記細胞類型，這些抗體使用碳簇束檢測。通過該方法，Hua Tian團隊在單個細胞水平整合了脂質信息，代謝信息和蛋白質信息，發現了新的腫瘤微環境信息，例如，腫瘤上皮細胞具有增強的抗氧化途徑，而快速分裂的細胞具有高水平的神經節苷脂。這種多組學的方法為研究癌細胞和免疫細胞之間的相互作用以及其他系統中的細胞之間的相互作用打開了大門。
囊泡
“你如何識別一個細胞的細胞類型是什么？”在美國伊利諾伊大學（University of Illinois）研究分析性神經化學的Jonathan Sweedler問道。早期的醫生根據不同腦細胞的形狀或在顯微鏡下的樣子給它們命名，星形膠質細胞、錐體細胞、枝狀吊燈細胞等，但這種命名方法并不能揭示細胞的功能。隨著神經科學家開發出測量大腦中生物化學物質的方法，細胞被它們釋放的化學物質所定義：細胞可以是多巴胺能類型、羥色胺能類型、氨基丁酸能類型等，但這些名稱與形態學類別并不完全重疊。
相同的星形膠質細胞面對不同的神經元細胞，例如分泌谷氨酸和氨基丁酸作為神經遞質的神經元細胞或者分泌多巴胺和血清素作為神經遞質的神經元細胞，它們會有不同的轉運體和酶來處理這些信號，這些差異是否意味著它們是一種不同的細胞類型？同一個細胞在不同環境中，具有不同的代謝組信息。因此Sweedler教授更關注于細胞的本身狀態而非細胞的類型。神經元細胞將化學信號，如激素和神經遞質，包裹成脂質囊，稱為囊泡。囊泡是比細胞更小的單位，一個細胞包含大量的囊泡，而Sweedler團隊采用MALDI-MS來分析這些單獨的囊泡，并探究其異質性。
Sweedler團隊的研究人員將數千個細胞器分散在一個顯微鏡載玻片上，它們之間有足夠的空間，從而激光一次只能擊中一個物體。接下來，他們用顯微鏡對載玻片及其物體進行成像。然后，一個機器學習系統對圖像進行分類，識別出最有可能是囊泡物體的坐標，這些坐標被用來引導質譜儀激光器進行瞄準，這一自動化的過程能夠在一張載玻片中捕獲數千個光譜。Sweedler團隊使用海蛞蝓的細胞作為研究對象，因為它們的細胞器相當大，直徑約為0.5-2微米。他們確定了三個不同的密集核心囊泡群體，它們包含不同的，但重疊的肽激素的分布。
對單細胞水平上囊泡的研究有助于提高我們對涉及細胞間信號傳導的疾病的理解，以及激素和神經遞質在各種生理功能中發揮作用，如晝夜節律、維持水-鈉平衡調節等功能。
溶酶體
囊泡使細胞之間的交流成為可能，而溶酶體可能是保持我們身體年輕的原因。大多數真核細胞含有溶酶體，即充滿消化酶的膜結合細胞器，可以分解細胞蛋白質或摧毀細菌和病毒，它們的新陳代謝也非常活躍。中國科學技術大學的熊偉教授解釋道：“溶酶體對于維持能量和代謝穩態、信號轉導、受損蛋白質和細胞器的恢復至關重要。”
溶酶體在細胞衰老和癌癥中都發揮著作用，了解細胞內部發生的代謝過程可以有助于得到關于如何減緩衰老或腫瘤的新藥物靶點的信息。但是溶酶體是高度異質性的：一個單個細胞可能包含數百個，它們的大小、密度和酶的組成都不同。“雖然研究人員已經確定了幾種不同類型的溶酶體，但到目前為止，還沒有令人滿意的溶酶體分類方法，”熊偉教授說，“考慮到它們在生理和病理過程中發揮功能的巨大異質性，單溶酶體技術的發展是充分了解不同類型溶酶體特征的先決條件。”
熊偉教授團隊已經創建了一個單溶酶體質譜(SLMS)平臺，該平臺結合了溶酶體膜片鉗記錄技術與基于納米材料的電噴霧電離質譜技術，同時檢測溶酶體的電生理特性及其代謝組信息。熊偉教授團隊根據溶酶體代謝組信息，將溶酶體分為五種亞型。其中兩種亞型對應于先前假設的溶酶體類型，即自噬溶酶體和內溶酶體，而另外其他三種亞型都是新發現，而來自完全不同細胞類型的五個溶酶體亞群之間存在著驚人的一致性。SLMS方法還成功地檢測到氨基酸、糖類及其衍生物的信息，熊偉教授團隊研究表明隨著細胞年齡的增長，溶酶體在分解大型生物分子方面的效率降低了。同樣，研究人員發現，不同類型癌細胞中的溶酶體中的代謝組信息存在差異。
正如熊偉教授所說：“越來越多的證據表明，衰老和癌癥與溶酶體及其內部代謝過程密切相關，通過研究不同類型的溶酶體在衰老或癌癥過程中的代謝功能變化，就有可能開發出新的抗衰老或抗癌藥物。”
嘌呤小體
空間解析單細胞水平的代謝組還可以為細胞如何進行其化學反應提供證據，如生物合成。當細胞分裂時，它們需要一種自己制造“建筑材料”的方法——從頭嘌呤合成是細胞從頭開始產生更多嘌呤核苷酸的過程，這種方法受到癌細胞和其他快速增殖細胞的青睞，而正常細胞則傾向于通過補救合成途徑回收嘌呤。
Hua Tian團隊與在賓夕法尼亞州立大學研究酶復合物組裝和動力學的Stephen Benkovic合作，使用GCIB-SIMS尋找“嘌呤小體”，這是細胞中生物合成研究的熱點，可以證明酶簇的假說。嘌呤的生物合成利用了來自線粒體的代謝物，研究人員假設，從頭嘌呤生物合成的中間產物和最終產物將定位于線粒體附近，而不是擴散到整個細胞中。事實上，這就是他們的發現。Hua Tian團隊使用GCIB-SIMS來定位中間產物，GCIB-SIMS提供了一個1微米乘1微米像素的細胞圖，該高分辨率小到足以捕獲嘌呤小體。他們發現了嘌呤合成酶復合物中的代謝通道和與線粒體關聯的直接證據，同時他們發現了一些離散的高濃度的中間代謝物AICAR，以及嘌呤生物合成過程中的其他明顯的中間產物。“這真的為單細胞代謝組學提供了一個新的機會，”Hua Tian說，“它可以幫助發現癌癥治療中重要的代謝弱點”
小結
單細胞代謝組學比基因組學或轉錄組學提出了更多的前沿挑戰，推進單細胞代謝組學，研究人員將解決幾個關鍵點：
1、代謝組變化迅速，這意味著在收集一個樣本進行分析的過程中，該樣本的代謝組可能發生改變。
2、代謝物在單個細胞中的表達豐度可能差異很大，微少的代謝物含量需要高靈敏度方法來檢測。
3、與基因組和轉錄組只有幾個不同的核苷酸堿基不同，代謝物有各種形狀和大小，需要開發有效的軟件方法來區分異構體。
4、為了了解異質細胞群是如何相互作用的，分析細胞的原生環境，將代謝組數據與細胞的物理特征和細胞微環境準確匹配變得至關重要。
隨著研究人員開始克服這些挑戰，其給精準醫療的發展帶來的獲益變得更加突出。例如，利用代謝組學來研究從患者的腫瘤樣本中培養的類器官。多種藥物可以同時在類器官上進行測試，而不是用藥物治療癌癥患者并等待觀察是否有響應。單細胞代謝組學可以揭示腫瘤細胞對每種藥物的應答，而這種應答是細胞在自然狀態下最真實的反應，這就是單細胞代謝組學的魅力！
隨著單細胞代謝組學技術的不斷發展，一場代謝組學革命正從早期組學中接過接力棒，向我們走來！
Single-cell metabolomics hits its stride
Published online: 3 December 2021 https://doi.org/10.1038/s41592-021-01333-x
