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【珍藏版】IF 90+鐵死亡重磅綜述
在細胞的各式花樣死法中，鐵死亡（ferroptosis）作為一種新興的死亡方式，近年來越來越受到大家的關注。鐵死亡是一種鐵依賴性的，區別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型的細胞程序性死亡方式。有關鐵死亡的研究方興未艾，相信大家都好奇該領域目前究竟取得了哪些進展，以及我們是否能夠站在巨人的肩膀上，進一步大展拳腳呢？今天小編分享一篇發表在《Nature reviews Molecular cell biology》雜志上的關于鐵死亡的綜述文章“Ferroptosis: mechanisms, biology, and role in disease”，影響因子足足90+，權威性不言而喻啊[端莊嚴肅崇拜臉]。
摘要
自2012年提出“鐵死亡”以來，相關研究在過去幾年中呈指數增長。鐵死亡是鐵依賴性的磷脂過氧化作用驅動的一種獨特的細胞死亡方式，受到多種細胞代謝途徑的調控，其中包括氧化還原穩態、鐵代謝、線粒體活性和氨基酸、脂質、糖的代謝，以及各種與疾病相關的信號途徑。有趣的是，具有多重藥物抗藥性的癌細胞，尤其是處于間充質狀態且易于轉移的腫瘤細胞，非常容易發生鐵死亡。此外，許多器官損傷和退行性病理是由鐵死亡引起的。因此，通過對誘導和抑制鐵死亡對其進行藥理調節，在治療耐藥性癌癥、缺血性器官損傷和其他與脂質過氧化密切相關的退行性疾病上具有巨大的潛力。在本篇綜述中，作者總結了當前對于鐵死亡分子機制和調控網絡的研究，鐵死亡在腫瘤抑制和免疫監控中的潛在生理功能和病理作用，以及其靶向治療潛能。更重要的是，正如其他所有快速發展的研究領域一樣，在鐵死亡的研究中，錯誤的觀念和不恰當的實驗方法也帶來了巨大的挑戰。因此，本綜述也旨在探討這些問題，并為鐵死亡研究提供可重復且可靠的實用性指南。最后，本文也討論了今后對于鐵死亡研究的主要關注點和迫切需要解決的問題。
前言
細胞是生命的基本組織單位。因此，細胞增殖、分化以及死亡在不同的生命形式中都發揮重要作用。細胞的命運和功能受到環境和遺傳因素的雙重影響。決定細胞命運的最關鍵的軸之一是細胞對氧化應激的反應，因為大多數生物在還原/氧化的代謝過程中依賴于氧作為最終的電子受體。在導致細胞氧化應激的條件和氧源物種中，膜雙分子層中脂質的氧化修飾(例如脂質過氧化)已成為整合一系列環境和遺傳輸入的聯系，包括熱和輻射暴露、代謝、氧化還原穩態、免疫監控、細胞間接觸以及致癌和腫瘤抑制信號。事實上，這些看似不相干的過程緊密結合在一起，使細胞經歷鐵死亡，這是一種由不受限制的脂質過氧化導致的獨特的細胞死亡模式(圖1)。鐵死亡現在被認為可能是最廣泛和最古老的細胞死亡形式之一，雖然最初是在哺乳動物系統中研究的，但在進化較遠的物種中也觀察到類似鐵死亡的細胞死亡，例如那些屬于植物、原生動物和真菌王國的物種。
傳統上，細胞死亡最初被認為是被動的和不受調控的，直到在1970年間發現了程序性細胞死亡(PCD)的第一種形式：細胞凋亡，其在發育過程中受到程序性調控。其他更廣泛的被稱為程序性細胞死亡的細胞死亡不一定與發育過程相關，但都受到各種分子機制的調控。鐵死亡符合RCD標準: 鐵死亡由致命的脂質過氧化作用驅動，是細胞代謝和氧化還原平衡失衡的結果，并可以通過藥物或遺傳手段直接阻斷脂質過氧化或耗盡細胞內的鐵來阻止其發生。重要的是，越來越多的證據表明鐵死亡在腫瘤抑制和免疫中的潛在生理作用(圖1)。最近，鐵死亡也與某些真菌物種的發育和線蟲的發育衰老有關。此外，鐵死亡的病理生理學相關性，特別是作為癌癥和缺血性器官損傷的治療方式，也已經被證明(圖1)。
盡管在2012年才新出現鐵死亡這個詞，但類似于鐵死亡的細胞死亡在很久以前就被發現了，例如，在神經細胞中存在一種氧化應激誘導的細胞死亡方式，被稱為氧化凋亡（oxytosis）。Harry Eagle在20世紀50年代和60年代的開創性工作表明，剝奪半胱氨酸/胱氨酸可以導致細胞死亡，而利用蛋氨酸和葡萄糖內源性合成半胱氨酸，即硫轉化，使細胞能夠抵抗這種細胞死亡。半胱氨酸是生物合成還原型谷胱甘肽(GSH)的限速底物，要么以半胱氨酸的氧化形式（胱氨酸）通過胱氨酸/谷氨酸反向轉運體（Xc-系統）和依賴鈉的中性氨基酸轉運蛋白B(0)AT1 (SLC6A19)被細胞攝入，要么以其還原形式半胱氨酸通過中性氨基酸轉運體進入細胞，或由內源產物經轉硫作用生成。GSH是哺乳動物細胞中最豐富的還原劑，在鐵硫簇生物發生中起重要作用，也是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽-s -轉移酶等多種酶的輔助因子。遺傳學上已經證明，GSH合成、Xc-系統和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)都可以保護細胞免受各種氧化應激條件引起的死亡，特別是導致硫醇缺乏的條件下，包括抑制Xc-系統活性。隨著GSH合成、Xc-系統和GPX4在鐵死亡中作用的確立，我們現在可以將所有這些早期研究放在鐵死亡的背景下。
盡管如此，從許多方面來看，鐵死亡仍是一個新興領域，只是在最近幾年才由氨基酸和脂質代謝、鐵穩態、氧化還原和硒生物學以及細胞死亡等相鄰領域合并而來。關于鐵死亡的研究論文發表數量呈指數級增長，因此需要對最近的研究進展進行全面的、批判性的審視，以便為不同領域的研究人員明確圍繞這個主題的關鍵發現、問題和挑戰。在此，我們深入分析了鐵死亡的機制和調控過程，潛在的生理功能，以及在疾病和治療中的作用。我們將討論該領域關鍵性的問題和面臨的挑戰，并對鐵死亡的研究提供切實可行的實驗建議。
這張示意圖顯示，鐵死亡是由磷脂過氧化作用引起的，這一過程依賴于代謝產物活性氧(ROS)、含有多不飽和脂肪酸鏈(PUFA-PL)的磷脂和過渡金屬鐵，細胞內和細胞間信號和環境壓力可通過調節細胞代謝和ROS水平影響鐵死亡。圖中還顯示了鐵死亡在疾病中的作用及其潛在的生理功能。
【知識補充】
1. 脂質過氧化：廣義指多不飽和脂類的氧化變質,人們稱之為油脂的酸敗。脂質分子在空氣中不易發生氧化作用,但一旦有自由基存在,就可導致脂質過氧化的發生,這是一個典型的自由基鏈反應過程,即在自由基或光或某種射線作用下,可使脂質分子LH脫氫形成脂質自由基L·,L·與氧反應形成脂質過氧自由基LOO·,此自由基再攻擊其他脂質分子,奪取其氫原子,生成新的自由基和脂質氫過氧化物LOOH,它在過渡金屬元素的催化下又產生LO·和LOO·,繼續引發和增長鏈反應,...
2. 程序性細胞死亡(PCD)：是由細胞內特定基因調控的分子程序介導的細胞死亡過程，在多細胞生物的正常發育過程和體內穩態維持中發揮至關重要的作用。
3. 半胱氨酸：一種生物體內常見的氨基酸，氧化形式為胱氨酸。
4. 谷胱甘肽(GSH)：是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，存在于幾乎身體的每一個細胞。谷胱甘肽有還原型(G-SH)和氧化型(G-S-S-G)兩種形式，在生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數。
5. 胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(Xc-系統)：是細胞內重要的抗氧化體系，可以攝取胱氨酸，排出谷氨酸。
6. 谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)：磷脂過氧化的抑制因子，GPX4酶在細胞內是唯一一個用于脂質過氧化物還原的GPX(谷胱甘肽過氧化物酶)。GPX4作用體現于，GPX4可以使得脂質過氧化的過氧鍵轉變為羥基，失去其過氧化物的活性。
7. 代謝產物活性氧(ROS)：指處在部分還原態的氧，例如過氧化氫、超氧化物、單線態氧和羥自由基，它們可能發生氧化反應并因此破壞包括脂質、蛋白質、DNA在內的細胞成分。
8. 多不飽和脂肪酸(PUFA)：指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸。單不飽和脂肪酸簡稱MUFA。
正文
為了方便大家理解，小編特意找出了“前言”中出現的專業名詞，并做了相關解釋，接下來就要直奔主題了。由于文章篇幅較長，小編將把全文分為三大部分進行解讀：（1）鐵死亡的調控機制;（2）鐵死亡相關的信號通路;（3）鐵死亡相關的疾病及治療。
一、鐵死亡的調控機制
近年來，人們對鐵死亡機制的認識突飛猛進。隨著胱氨酸/谷氨酸反向轉運體-GSH-GPX4通路在抑制鐵死亡中的作用被發現，目前磷脂氫過氧化物（PLOOHs，一種基于脂質的ROS形式）被確定為是鐵死亡的執行者（圖2）。最近又發現了GPX4非依賴性的鐵死亡監控通路。此外，在鐵死亡背景下，PLOOH的合成機制，特別是PUFAs（多不飽和脂肪酸，PLOOHs的前體物質）的合成與活化也已被廣泛研究。重要的是，所有這些研究最終都集中在細胞代謝上，揭示出鐵死亡和代謝途徑之間存在密切聯系。
(A) 在經典的鐵死亡調控通路中，胱氨酸通過胱氨酸/谷氨酸反向轉運體（system Xc-）進入細胞，接著在谷胱甘肽（GSH）或硫氧還蛋白還原酶1（TXNRD1）依賴的胱氨酸還原途徑中還原生成半胱氨酸，促進GSH生成。GSH是一種強效的還原劑，可作為谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的輔因子，在細胞內促進磷脂氫過氧化物（PLOOHs）還原為PLOOHs相應的醇（PLOHs）。谷胱甘肽-二硫化物還原酶（GSR）利用NADPH/H+提供的電子催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）重新生成GSH。(B) 兩項獨立進行的基因篩查研究中，發現FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）/泛醌(CoQ10)系統完全可以保護細胞免受由藥物抑制Gpx4或Gpx4基因敲除引起的鐵死亡。與GPX4/GSH不同，FSP1通過降低脂基水平上的泛醌/α-生育酚來防止脂質過氧化和與之相關的鐵死亡。(C) 其他鐵死亡抑制機制，包括鯊烯介導的和二/四氫生物喋呤（BH2/BH4）介導的對脂質過氧化的抑制，盡管這一過程的化學機制仍有待研究。
1.經典的GPX4調控鐵死亡機制（Cyst(e)ine/GSH/GPX4軸）
為了尋找新型抗癌小分子，Stockwell團隊從2001年開始進行了高通量篩選，并在2003年發現了一系列復合物，這些復合物能夠誘導細胞以一種獨特的、區別于細胞凋亡和細胞壞死的方式死亡。反向篩選結果表明，多種鐵離子螯合劑以及親脂性自由基捕獲型抗氧化劑（RTAs）可以抑制這種類型的細胞死亡。由于鐵在這種形式的細胞死亡中不可或缺，因此將這種細胞死亡形式命名為“Ferroptosis”，即鐵死亡。隨后在對鐵死亡機制的研究中確定了兩個細胞組分，Xc-系統和GPX4，利用化合物erastin和RSL3分別抑制它們的活性會誘導鐵死亡發生。
GPX4是Ursini及其同事通過生化純化發現的一種硒蛋白，是哺乳動物細胞中催化PLOOHs還原的主要酶。GPX4可將磷脂和膽固醇氫過氧化物還原為相應的醇，這個過程需要GPX4中硒代半胱氨酸殘基的催化活性以及主要由GSH提供的兩個電子，電子有時也可來自其他小分子硫醇，甚至蛋白質硫醇。Conrad團隊曾透徹研究過第一個Gpx4條件敲除小鼠模型，發現Gpx4的缺失會誘導小鼠胚胎成纖維細胞以脂質過氧化物依賴的、非凋亡的形式死亡，并引起小鼠大腦海馬區和皮質區內的神經退化。這個和其他幾個小鼠模型有助于描繪出更詳細的鐵死亡在體內相關性的圖像，這些將在下文進一步討論。
因為GPX4是主要的PLOOH中和酶，所以出現了erastin/RSL3誘導的鐵死亡機制：這兩種化合物都能滅活GPX4，RSL3直接滅活GPX4，而erastin間接滅活GPX4，主要通過抑制胱氨酸進入細胞使胞內半胱氨酸耗竭（半胱氨酸是是一種必不可少的細胞抗氧化劑，也是細胞內GSH的必要組成成分）。最終的結果是，PLOOHs累積，可能導致膜結構發生快速且不可修復的損傷，從而導致細胞死亡(圖2A)。從概念上講，這些發現明鐵死亡在機制上與其他已知的細胞死亡方式不同。基于此機制開發的藥理學和遺傳學工具使鐵死亡相關研究成為可能，而且這些工具已經成為研究鐵死亡必不可少的工具。
1.1磷脂過氧化反應
無限制的脂質過氧化是鐵死亡的標志。20世紀50年代的早期研究發現，微量元素硒、維生素E和半胱氨酸可以抑制脂質過氧化。脂質過氧化的啟動需要從磷脂上的多不飽和脂肪酸酰基(PUFA-PLs)中脫去兩個碳碳雙鍵之間的雙烯丙基氫原子，形成以碳為中心的自由基，并與分子氧反應生成過氧自由基(圖3)。如果不轉化為脂質過氧化氫并還原為相應的醇，自由基介導的反應的傳播將導致大量次級產物的產生，膜結構完整性被破壞，并最終導致細胞器和細胞膜破裂。因此，高PUFA-PL含量的細胞膜特別容易發生過氧化反應，已經在神經元中得到了證實。與此一致，全基因組單倍體和基于CRISPR/ cas9的篩選發現了兩種膜重塑酶，脂酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4 (ACSL4)和溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3 (LPCAT3)是導致鐵死亡的重要因素。ACSL4在鐵死亡中發揮作用是因為它更傾向于催化長鏈PUFAs（包括花生四烯酸20：4和腎上腺酸22：4）和輔酶A連接。然后，這些產物會被多種LPCAT酶重新酯化為磷脂，從而增加細胞內長鏈PUFAs在脂質和膜結構中的摻入。ACSL4的基因缺失會導致磷脂中長鏈PUFA尾向短鏈單不飽和脂肪酰基（MUFA）尾急劇轉變，其方式類似于ACSL435藥物抑制處理的野生型細胞。ACSL4缺陷細胞磷脂中的這種急劇轉變，使得Gpx4敲除細胞的增殖可以持續數月，這是之前從未觀察到的基因拯救。與上述機制類似，據報道，外源性補充MUFAs、硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD1）介導的細胞內MUFA生成，以及由ACSL3依賴的膜MUFAs富集可降低細胞受鐵死亡的影響。值得注意的是，在三陰性乳腺癌的一個細胞亞群中，ACSL4的表達水平與它們對于鐵死亡誘導劑的敏感性相關，且在耐藥的間充質癌細胞和透明細胞性腎癌細胞中觀察到了類似的相關性。因此，抑制ACSL4表達或許是細胞對鐵死亡脫敏的主要機制，這一過程可能受到不同的信號通路調控。相反，增加ACSL4表達或提高其活性，可能會在多種病理生理條件下促進鐵死亡。
毫無疑問，脂質雙分子層的不飽和程度是決定細胞對鐵死亡敏感性的關鍵因素，但關于脂質過氧化是如何啟動的仍有許多不確定因素和爭論。與共軛二烯相鄰的雙烯丙基碳具有已知的最弱的碳氫鍵，這些結構的增加會提高脂類的自氧化速率，如含有PUFA的食物在環境氧張力下會腐敗。可以想象，細胞自主產生的脂質烷氧自由基或羥基自由基可以啟動不依賴于酶促反應的脂質過氧化，而這一過程可由鐵作為催化劑的Fenton反應催化（圖3）。(稍后詳細說明)。
某些脂加氧酶(LOXs)是非血紅素鐵依賴的雙加氧酶，可以直接氧化生物膜的PUFAs，提示LOXs可能介導鐵死亡的誘導過程。已有一些結果支持這一可能性，如一些LOX的藥理學抑制劑能夠抑制鐵死亡，敲除12/15-LOX或應用LOX抑制劑黃岑素（baicalein）可以保護小鼠免受缺血性腦損傷和水腫的形成。然而，在Gpx4敲除小鼠中敲除12/15-LOX并不能保護小鼠成纖維細胞免受鐵死亡，也不能防止急性缺血性腎損傷或降低其致死率，也不能恢復T細胞特異性Gpx4-/-小鼠中的CD8+ T細胞。然而值得注意的是，LOXs主要與半胱氨酸缺乏誘導的鐵死亡相關，而非GPX4缺失誘導的鐵死亡，因此，有必要利用不同的模型進一步剖析LOXs在鐵死亡中發揮的作用。這些數據表明，在ALOX15活性缺失后可能有替代機制進行了補償，某些頻繁使用的“LOX特異性”抑制劑可能作為自由基捕獲型抗氧化劑（RTA）發揮了非特異性活性。事實上，最近的一項研究證實，最常用的LOX抑制劑具有RTA活性，因此對通常認為的LOX在鐵死亡中的重要作用提出了挑戰。此外，對人類所有LOX同工酶活性廣泛下調未能阻止RSL3誘導的鐵死亡，但很大程度上挽救了erastin誘導的鐵死亡，這可能是因為erastin處理激活了脂氧合酶。因此，在大多數情況下LOXs可能不是鐵死亡的關鍵驅動因素，但在某些情況下可能有助于鐵死亡的啟動和發展。Alox15（花生四烯酸-15-脂加氧酶）或者Alox12（花生四烯酸-12-脂加氧酶）的缺失分別在一些神經退行性或者癌癥抑制小鼠模型中表現出保護作用。然而，必須強調的是，這些酶在免疫系統中本身發揮著重要的生理作用，通過產生促炎和抗炎分子直接調節（神經）炎癥過程和腫瘤微環境，因此，它們的缺失并不一定與鐵死亡直接相關。先前的發現也支持這一觀點，GPX4通過所謂的“細胞過氧化物”調控制脂加氧酶和環加氧酶的活性，因為這兩種二十烷酸代謝酶都需要通過脂質氫過氧化物氧化它們的鐵，以捕獲分子氧并將其摻入到PUFAs中。值得注意的是，有報道稱ALOX12在過氧化物引發的p53依賴性鐵死亡中必不可少，而且這種形式的鐵死亡相當獨特，因為它似乎不需要ACSL4參與；另外，據報道，磷脂酰乙醇胺結合蛋白1 (PEBP1)可與某些LOXs形成復合物，改變其對PUFA-PLs底物的特異性。
除了有爭議的LOXs在鐵死亡中的作用外，最近的研究表明，廣泛表達的細胞色素P450氧化還原酶(POR)在啟動脂質過氧化中發揮作用。NADPH作為電子供體從POR接受電子后，下游電子受體如細胞色素P450和CYB5A被還原，進而通過從PUFAs中提取亞甲基氫或還原鐵直接或間接觸發脂質過氧化反應。
盡管在細菌膜中普遍缺乏PUFAs，銅綠假單胞菌能夠表達一種分泌型脂氧合酶(PA-LOX)。這種酶可誘導人紅細胞膜脂氧化，也可誘導人支氣管上皮細胞鐵死亡。因此，囊性纖維化患者表現為磷脂酰乙醇胺中花生四烯酸氧化水平升高，而磷脂酰乙醇胺被報道是在鐵死亡的細胞和組織中檢測到的主要磷脂形式之一。這種跨生物的鐵中毒誘導機制耐人尋味，值得進一步研究，以確定這一機制是否被其他低等生物利用。
脂質過氧化是鐵死亡的標志，它以非酶催化和酶催化的方式發生(酶催化過程用虛線框標記)。對于后者，脂加氧酶(LOXs)和/或細胞色素P450氧化還原酶(POR)被認為是通過脂質氧化啟動脂質過氧化過程，但目前尚無證明脂加氧酶（LOXs）參與鐵死亡過程的明確遺傳學證據。脂質過氧化可分為起始、放大和終止三個階段，如不同顏色的箭頭所示。脂質過氧化抑制系統包括酶和小分子作用于不同水平的脂質過氧化級聯反。
1.2細胞代謝與鐵死亡
很明顯，多種代謝反應可以導致細胞產生PLOOHs，越來越多的證據表明，代謝在鐵死亡中起著核心作用。Jiang團隊試圖確定代謝如何影響細胞命運的研究揭示了鐵死亡與代謝的復雜關系。他們研究了自噬這種難以捉摸的促進細胞死亡的功能。自噬作為應對各種壓力的重要生存機制，是否以及如何促進細胞死亡(即自噬細胞死亡)已經爭論了幾十年。出乎意料的是，他們發現在氨基酸饑餓(一種觸發有效自噬的條件)時，自噬促進了一種快速的非凋亡、非壞死形式的細胞死亡，但僅僅是在細胞處于血清充足的完全培養基的前提下。他們隨后發現，這種形式的細胞死亡需要鐵載體轉鐵蛋白和血清中的氨基酸谷氨酰胺，而從細胞培養基中去除胱氨酸則足以觸發細胞死亡。因此，這種類型的細胞死亡（即鐵死亡）是由半胱氨酸缺乏(類似于erastin)誘導的，并依賴于轉鐵蛋白。在胱氨酸缺乏的情況下，自噬通過降解鐵蛋白（也稱為鐵自噬）導致細胞內不穩定鐵含量上升，從而使細胞對鐵死亡敏感，誘導鐵死亡（圖4）。谷氨酰胺代謝或谷氨酰胺分解對半胱氨酸缺失誘導的鐵死亡是必須的，從而將鐵死亡與氧化代謝聯系起來。谷氨酰胺分解產生α-酮戊二酸鹽，能夠為線粒體TCA循環（三羧酸循環）提供能量，這表明線粒體的正常代謝功能似乎與鐵死亡相關，隨后通過多種藥理學、細胞學和遺傳學分析得到了驗證（圖4）。值得注意的是，線粒體早前已被證明線粒體已被證明是氧化凋亡（oxytosis）的活躍參與者。
基于這些發現，人們也提出了更多的假設和問題，例如：作為線粒體TCA循環的主要燃料，葡萄糖是否調控鐵死亡？的確，葡萄糖饑餓近年來被發現可以抑制鐵死亡。然而，從機制上講，這一現象似乎主要由AMPK所介導，而非通過TCA和線粒體呼吸調節（稍后詳述）。相關的問題是，即使是在富含葡萄糖的條件下培養細胞，如果谷氨酰胺僅僅通過維持線粒體呼吸來發揮促進鐵死亡的作用，那么谷氨酰胺如何在半胱氨酸缺乏誘導的鐵死亡中起關鍵作用？因此，有必要對谷氨酰胺分解在鐵死亡中的作用進行詳細的研究。此外，線粒體代謝是否通過產生特定的脂質前體促進PLOOH合成（TCA循環的中間產物可以促進脂質合成）或通過促進ROS產生（氧化代謝反應的天然副產物）促進鐵死亡？已經有研究發現線粒體活性和谷氨酰胺分解對于半胱氨酸缺乏誘導的鐵死亡是至關重要的，但對于抑制GPX4誘導的鐵死亡卻并非必不可少，這為后一種可能性即線粒體代謝通過促進ROS產生促進鐵死亡提供了更多的支持。
除了線粒體外，植物細胞擁有另一個獨特的細胞器-葉綠體，可以進行一連串的氧化還原合成代謝反應。由于在植物中已經發現依賴于鐵和ROS的鐵死亡，一個有趣的推測是，在植物中葉綠體也可能在鐵死亡的調節中發揮重要作用。
該圖描述了多種代謝事件(如脂質合成、自噬和線粒體TCA循環)和信號通路(如E-cadherin-NF2-Hippo-Yap通路，葡萄糖調節的AMPK信號通路，p53和BAP1的腫瘤抑制功能)對鐵死亡的調控。
1.3鐵死亡中的鐵
細胞代謝的基本功能，特別是磷脂過氧化，解釋了鐵死亡過程為什么依賴鐵。首先，參與磷脂過氧化的代謝酶LOXs和POR發揮催化活性需要鐵的參與，而鐵對于參與細胞活性氧生成的大量代謝酶也是必不可少的。其次，非酶催化的、鐵依賴的Fenton鏈式反應可能對于鐵死亡是必要的：PLOOHs在GPX4被抑制時會持續存在更長時間，從而引發Fenton反應，使鐵死亡標志物PLOOHs的含量迅速增加（圖3）。PLOOHs能夠與亞鐵離子和鐵離子反應，分別產生自由基PLO?和PLOO?? ，這些自由基與PUFA-PLs反應，進一步促進PLOOH的生成。
考慮到鐵在細胞生存和死亡中的核心作用，細胞內鐵穩態受到精細控制并不奇怪。鐵調節蛋白IRP1和IRP2參與了與細胞內鐵儲存/釋放和攝入/排出相關基因的轉錄后調節。可以想象，許多細胞過程通過改變細胞內的不穩定鐵含量而改變細胞對鐵死亡的敏感性。如轉鐵蛋白及其受體通過將鐵導入細胞而共同促進鐵死亡。相反，促進細胞內鐵排出已被證明使細胞對鐵死亡具有更強的抵抗力。此外，血紅素加氧酶1（HO-1）介導的血紅素降解會釋放鐵，也與鐵死亡相關。然而一系列相互矛盾的數據顯示HO-1既可促進鐵死亡也可抑制鐵死亡。
最近，對小鼠模型的體內研究進一步闡明了鐵調控在鐵死亡中的作用。例如，敲除鐵蛋白重鏈基因可能通過促進鐵死亡導致心肌病。有趣的是，在小鼠肝細胞中特異性敲除轉鐵蛋白導致的表型出人意料：給敲除小鼠喂養富鐵飲食增加了肝細胞的鐵負荷（肝細胞是體內合成轉鐵蛋白的主要細胞類型），這導致小鼠更容易出現肝纖維化，親脂性RTAs80（親脂性自由基捕獲型抗氧化劑）可改善這種情況。這項研究進一步表明轉鐵蛋白表達缺失后，SLC39A14（一種金屬轉運蛋白）在肝細胞中代償性上調，導致鐵的過量攝入。
2.GPX4非依賴性鐵死亡調控機制
盡管半胱氨酸/胱氨酸-GSH-GPX4軸被認為是哺乳動物中對抗鐵死亡的主要系統，全基因組篩查最近發現了GPX4非依賴性的鐵死亡監控機制。
2.1 NAD(P)H/FSP1/CoQ10軸
Conrad團隊和Olzmann團隊分別利用基因抑制劑和CRISPR-Cas9篩選技術，鑒定出鐵死亡抑制蛋白1 (FSP1)是與硫醇依賴軸不同的第二種鐵死亡關鍵因子（GPX4非依賴性）。FSP1以前被稱為AIFM2，因為它與AIFM1(凋亡誘導因子線粒體相關1)同源。AIFM1最初被認為像AIFM2一樣促進凋亡，但現在發現AIFM1與線粒體膜間隙蛋白轉運及正確折疊相關。此外，實際上FSP1缺乏實質性的促凋亡功能，但可以保護細胞免受GPX4基因缺失或抑制引起的鐵死亡。
FSP1被肉豆蔻酰化修飾，并與包括細胞質膜、高爾基氏體和細胞核周結構在內的多種細胞膜結構相聯系。突變FSP1的肉豆蔻酰修飾位點會使它喪失抗鐵死亡功能。機制上講，由于FSP1具有NADH：泛醌氧化還原酶活性，FSP1通過還原泛醌（CoQ10）/泛醌的不完全氧化產物半氫醌產生泛醇，這能夠直接減少脂質自由基，終止脂質自氧化反應，或者間接的通過促進氧化型α-生育酚自由基（維生素E，一種強大的天然抗氧化劑）再生，這是脂類中最強大的天然斷鏈抗氧化劑(圖2B)。這些研究也解決了一個長期存在的謎題，即為什么在一些細胞和組織中存在大量的線粒體外泛醌，而這與泛醌在線粒體電子傳遞鏈中的經典功能是不一致的。
2.2 GCH1/BH4/DHFR軸
利用CRISPR/ cas9篩選技術，GTP環水解酶-1 (GCH1)最近被報道可通過其代謝產物四氫生物蝶呤(BH4)和二氫生物蝶呤(BH2)抵抗鐵死亡。BH4被證明可能通過雙重機制，即既作為直接RTA(需要通過二氫葉酸還原酶DHFR再生)，又參與CoQ10合成，保護含有兩個PUFA尾的磷脂免受氧化降解（圖2C）。盡管GCH1在保護組織和器官免受鐵死亡中的作用仍有待闡明，但已有基因敲除研究表明，GCH1在小鼠體內的缺失會導致小鼠在妊娠中期的心動過緩和胚胎死亡。
2.3 鯊烯積累
除了直接調控脂雙層中的過氧化物或通過一些天然的自由基捕獲型抗氧化劑調節磷脂自由基外，細胞也可能通過一些其他的內在機制保護自身免受有害的脂質過氧化。關于這點，膽固醇途徑中的一種代謝物鯊烯，已被報道其積累會在固醇缺陷型淋巴癌細胞系和原發腫瘤中具有抗鐵死亡活性，盡管尚未證明這是癌癥亞型特異性效應還是一種普遍的保護機制(圖2C)。
二、鐵死亡相關的信號通路
不難想象，凡是能夠調控鐵死亡的生物學過程，如促進或調控這一過程的分子、氧化還原穩態和鐵穩態以及細胞代謝，都可能會影響鐵死亡。正如預期的那樣，氧化應激反應轉錄因子NRF2可以通過激活多個經典靶基因的表達來緩解鐵死亡。此外，越來越多的證據表明，在特定的生物學背景下，多種信號通路可以控制細胞對鐵死亡的敏感性。
1. GPX4和FSP1的調控
雖然GPX4和FSP1在抑制鐵死亡方面扮演著重要的角色，但在生理和病理條件下，GPX4和FSP1是如何在轉錄、翻譯以及同等重要的翻譯后/活性水平上發揮調控作用，我們還知之甚少。目前已知的是，GPX4和FSP1似乎在某種程度上和甲羥戊酸途徑相交集：甲羥戊酸途徑是蛋白異戊稀化修飾方式之一，可以穩定Trsp（硒代半胱氨酸特異性tRNA），而Trsp是合成包括GPX4在內的硒酶所必需的，另外，甲羥戊酸途徑的終產物之一泛醌(CoQ10)是FSP1的主要底物。
GPX4是人體內25種硒蛋白之一，其表達受到嚴格調控。有研究表明，增加細胞內硒含量可以協同激活轉錄因子TFAP2c和Sp1來促進神經元中GPX4的表達。然而值得一提的是，和真正的硒反應蛋白P（SELENOP）、GPX1和GPX3不同，GPX4可以被認為是一種在大多數組織和器官中組成性表達的管家蛋白。已報道的其他調控GPX4表達的轉錄因子包括腸上皮細胞中的CEBP1和C/EBPα和某些癌細胞中的NF-Y。據報道轉錄后，GRSF1（鳥嘌呤富含序列結合因子1）能夠與線粒體型GPX4 mRNA的5’非編碼區結合，促進線粒體內GPX4的翻譯，從而在精子發育過程中起著重要的作用。然而，以上調控事件與鐵死亡的關系尚不明確。
越來越多的證據表明，GPX4的活性和穩定性也受到調控。例如，持續的氧化應激導致GSH耗竭，這使得GPX4中硒代半胱氨酸活性位點的GSH依賴性還原受損，從而導致GPX4通過β切割過程形成無氧還活性的脫氫丙氨酸和GPX4不可逆的功能失活，此外，在亞硒酸和鄰近氨基酸之間形成的硒酰胺可以保護酶發生不可逆失活。然而，在缺血-再灌注損傷(IRI)等病理條件下，這些機制是否發揮作用還需要進一步研究。盡管有研究報道稱腸道缺血與較低的GPX4活性和含量有關。此外，包括RSL3在內的多個鐵死亡誘導劑最終都會通過硒代半胱氨酸活性位點的共價修飾、干擾甲羥戊酸代謝以及鐵依賴的氧化應激等機制導致GPX4耗竭。
作為另外一種重要的鐵死亡抑制因子，FSP1最初是作為p53應答基因被發現的，因此FSP1還被稱為p53應答基因3（p53-responsive gene 3，PRG3）。FSP1是轉錄因子NRF2、CRBP和PPARα的靶基因。有趣的是，據報道在T淋巴母細胞性淋巴瘤細胞中，長鏈非編碼RNA MEG3（母系表達基因3）上調FSP1的表達，miR-214下調FSP1的表達，而這兩種RNA也同時參與腫瘤發展。除了轉錄調控，幾乎沒有人知道FSP1的氧化還原酶活性是如何被調控的，以及FSP1的亞細胞定位如何調控其在不同生理、病理過程中的作用。但FSP1能夠同時作用于還原性和氧化性底物（如NADH、NADPH、CoQ10和α-生育酚），表明其活性的調控過程較復雜。
2. E-cadherin-NF2-Hippo-YAP信號通路
Hippo-YAP通路具有多種生理功能，包括細胞增殖和器官大小控制。這條通路在鐵死亡中的作用始于一個有趣的研究:在半胱氨酸饑餓和GPX4抑制劑的誘導下，高密度生長的細胞更能抵抗鐵死亡。這一結果與更早的一些重要發現類似，如在極高密度生長的細胞或將細胞進行球體培養（有利于細胞與細胞間接觸）可以提高GPX4敲除細胞的生存率。從機制上來講，細胞密度對上皮細胞鐵死亡的調控作用是由上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）介導的細胞間接觸所介導，這種細胞間相互作用能夠通過NF2（也被稱為Merlin）腫瘤抑制蛋白激活細胞內Hippo信號通路，從而抑制腫瘤蛋白YAP的核轉位和轉錄活性。由于YAP靶向多個鐵死亡調控因子，包括ACSL4、轉鐵蛋白受體TfR1等，因此鐵死亡的發生最終依賴于Hippo通路的活性，抑制Hippo通路和激活YAP均可以促進鐵死亡（圖4）。與此一致，研究發現YAP的同源物TAZ在腎癌細胞（主要表達TAZ而不是YAP）中以調控細胞密度的方式促進鐵死亡。
E-cadherin-NF2-Hippo-YAP通路在調控鐵死亡方面所發揮的作用具有重要的意義。首先，由于該途徑的多個環節在癌癥中經常發生突變，誘導鐵死亡可能是治療這種類型癌癥的潛在療法，這個話題將在下面作進一步討論。其次，在不表達E-cadherin的非上皮細胞中也觀察到細胞密度依賴的鐵死亡現象，說明其他類型的鈣粘蛋白（cadherin）或細胞黏附因子也可能以類似的機制來抑制鐵死亡。第三，Hippo-YAP通路在發育過程中起著重要的作用，并且該通路與其他信號通路相互作用，因此可以通過Hippo-YAP通路研究鐵死亡與其他正常生理功能的聯系。推測一下，鈣粘蛋白是否在多細胞生物中進化成這樣一種方式:它們不僅在物理上連接細胞，通過將信號轉導到細胞內來介導細胞間的通訊，而且還作為一種古老的機制來保護細胞免受氧化應激激損傷，包括氧化應激最致命的形式--鐵死亡。所有這些事件都是多細胞生物存在的必要條件。事實上，鈣粘蛋白的表達可以一直追溯到原始的后生動物。
3. AMPK信號通路
直觀地說，能量和代謝應激會引起能量損失，從而導致維持體內平衡所需的系統級聯失靈，例如能量依賴的跨細胞膜的離子濃度失衡，最終導致細胞死亡。此外，通過葡萄糖饑餓給予細胞代謝壓力會促進細胞中ROS的產生，表明葡萄糖饑餓可能促進鐵死亡。令人驚訝的是，葡萄糖饑餓反而抑制細胞鐵死亡，而這種保護作用依賴于能量感應激酶AMPK的活性。因此，當葡萄糖缺乏時，AMPK被激活，啟動了一種能量應激保護程序，以對抗鐵死亡，這涉及到PUFAs的生物合成受損，而PUFAs是脂質過氧化誘導的鐵死亡所必須(圖4)。由于能量應激保護程序的激活可以保護腎臟免受缺血-再灌注損傷（IRI）。這種保護機制可能是是保護機體免受能量耗竭導致的器官損傷的第一道防線，而器官損傷往往伴隨著能量衰竭。
4. HIF2α-HILPDA信號通路
考慮到鐵死亡是由磷脂過氧化引起的，一直以來懸而未決的問題是鐵死亡過程是否依賴于氧濃度。早期實驗表明，在1%氧環境下erastin誘導的鐵死亡并沒有受到影響，這表明缺氧并不會抑制鐵死亡。最近的一項研究表明，缺氧實際上可以引起細細胞對鐵死亡的敏感性，如透明細胞癌對GPX4抑制劑引起的鐵死亡高度敏感，這種敏感性是由HIF2α亞型通過缺氧誘導脂滴相關蛋白(HILPDA)通過PUFA脂質重塑驅動的。透明細胞癌在組織學上具有典型的清晰胞漿染色，且很難治療，揭示這一發現的臨床意義。因此推測，HIF2α-HILPDA驅動的細胞鐵死亡敏感性很有可能是一種古老的消除新生低氧性腫瘤的方法。
三、鐵死亡相關的疾病及治療
盡管鐵死亡在生理學方面的作用還不清楚，但它在人類疾病中的功能已被廣泛研究。重要的是，在不同的臨床前動物模型中，鐵死亡的藥理學調控被證明是治療癌癥和IRI（缺血-再灌注損傷）的潛在治療方式。在這一部分，我們將重點討論鐵死亡在癌癥和缺血-再灌注損傷中的作用和治療意義，正如Box1中所討論的那樣，鐵死亡與許多其他疾病的發病機制有關。
1. 鐵死亡與癌癥
人們在癌癥研究之初就發現了鐵死亡與癌癥的相關性。在尋找新的癌癥治療化合物的過程中，發現了鐵死亡化學誘導劑。隨后的機制研究表明許多癌癥相關基因和信號通路都可以調控鐵死亡。對凋亡和常規癌癥療法抵抗的間充質干細胞和去分化的癌細胞，以及被稱為“持續細胞”的癌細胞都對鐵死亡誘導高度敏感。進一步表明誘導鐵死亡作為一種新的癌癥治療方法的前景。
從概念上講，鐵死亡是一種氧化應激誘導的細胞死亡形式，由于癌細胞整體代謝更活躍和ROS含量更高，因此更容易發生鐵死亡。此外，有研究表明，癌細胞通常需要攝入大量的鐵，這可能進一步使它們對鐵死亡敏感。然而，癌細胞也可能利用遺傳學或表觀遺傳學機制來抵抗這些代謝或氧化壓力，如上調SLC7A11或者抗氧化轉錄因子NRF2的表達。因此，某種特定的癌細胞是對鐵死亡更敏感還是更具有抵抗力是由其特定的遺傳背景決定的。在發展基于鐵死亡誘導的癌癥療法時，癌細胞的基因組學以及下面討論的其他因素應當被充分考慮。
1.1 腫瘤抑制中的鐵死亡
多種腫瘤抑制因子被發現可增強細胞對鐵死亡的敏感性，因此，可以合理的推斷鐵死亡有助于這些腫瘤抑制因子的抗腫瘤活性，也就是說，抑制腫瘤可能是鐵死亡固有的生理功能。
在這些腫瘤抑制因子中，p53在鐵死亡中的作用已被透徹研究。Gu等通過詳細分析p53的特異性賴氨酸乙酰化位點，發現p53可以通過抑制system Xc亞基SLC7A11的轉錄來促進鐵死亡，這一功能可能有助于p53在體內和體外的腫瘤抑制功能。此外，在非洲人群中發現一種p53的易患癌癥的單核苷酸多態性P47S富集，并使癌細胞對p24更具抵抗力。雖然這些發現與鐵死亡在p53介導的腫瘤抑制中的作用一致，但目前還不清楚這些特定突變除了使p53喪失促鐵死亡活性外，是否還有其他功能。值得注意的是，與這些研究結果相反，p53也被報道通過調控其他轉錄靶點來抑制鐵死亡。考慮到p53可以調節涉及各種生物學過程的大量靶基因，p53在鐵死亡中的確切作用很可能取決于其所處的特定環境。
與p53類似，腫瘤抑制因子和表觀遺傳調節因子BAP1也可以通過下調SLC7A11的表達促進鐵死亡。但與p53不同的是，p53的促鐵死亡活性已被證明在體內足以抑制腫瘤發生，而BAP1的促鐵死亡活性對腫瘤的抑制程度目前還不清楚。
延胡索酸酶，一種催化延胡索酸在三羧酸循環中轉化為蘋果酸的酶，它也是平滑肌瘤和腎乳頭狀細胞癌中的腫瘤抑制因子。這種代謝酶為何有看似矛盾的抑制腫瘤生長的功能，以及它為何僅在少數特定類型的癌癥中發揮作用，仍不清楚。延胡索酸酶參與線粒體TCA循環的促鐵死亡功能或許可以解釋這一問題。在某些類型癌癥的發展過程中，腫瘤細胞發生氧化應激反應，這使得這些細胞更易發生鐵死亡。在這些條件下，延胡索酸酶功能的喪失會損害線粒體的氧化功能，這一方面會阻礙細胞生長，另一方面會使細胞對鐵死亡更加抵抗，從而提高細胞的生存能力和癌變的可能。
1.2 免疫監管中的鐵死亡
不同于其他形式的細胞死亡，細胞凋亡、焦亡和壞死等在免疫應答中受免疫系統調節，而通過外部或內部機制誘發的鐵死亡是否能起到類似的“生理作用”，在很大程度上仍不清楚。由于鐵死亡的復雜性和在眾多代謝途徑的直接作用，免疫系統很可能靶向鐵死亡過程中的某些關鍵步驟。Sato團隊早期研究發現，干擾素-γ (IFN-γ)可抑制xc-系統的活性，而由CD8+T細胞產生的IFN-γ最近被證明可能參與了增強腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性，但免疫細胞對鐵死亡的這種直接誘導機制是否具有生理意義目前還不清楚。早期研究發現，IL-4和IL-3抑制GPX4表達，同時增強ALOX15的表達，從而促進花生四烯酸代謝物的產生，全面激活免疫系統。由于GPX4可以通過降低脂質過氧化物度（lipid peroxide tone）來抑制LOXs和環加氧酶活性， 因此GPX4活性受損可能對免疫調節性脂質介質的分泌產生顯著影響，這能夠提醒免疫系統細胞正處于鐵死亡敏感的環境中，從而促進免疫監管。
鐵死亡在免疫應答中的作用不僅局限于哺乳動物。最近一項研究表明，鐵死亡提高了水稻對真菌M.Oryzae4感染的宿主免疫力。在水稻中誘導類似鐵死亡過程的細胞死亡與脂質過氧化有關，可被鐵離子螯合劑抑制，防止真菌稻瘟病菌感染。有趣的是，M.oryzae的特定細胞發生類鐵死亡為其入侵宿主和在宿主體內發育所必需。因此，這一發現也首次表明了鐵死亡在發育中的潛在功能。
1.3 與鐵死亡相關的癌癥生物標志物和基因突變
多種癌蛋白、腫瘤抑制因子和致癌信號轉導途徑可調控鐵死亡。因此，它們在癌癥中的變化可以作為生物標志物來預測癌細胞對誘導鐵死亡療法的反應。
以E-cadherin-NF2-Hippo-YAP通路為例，基于TCGA分析，腫瘤抑制因子E-cadherin功能缺失突變是乳腺小葉浸潤癌（~65%）和彌漫性胃腺癌（~25%）等腫瘤的常見事件；30%的間皮瘤和所有被稱為NF2疾病的良性病變中都發生了NF2功能缺失突變；同樣地，在多種癌癥中觀察到Hippo通路成員LATS1/2腫瘤抑制因子的突變。雖然很少見到YAP基因突變，但YAP基因的過表達或翻譯后激活卻經常在腫瘤中發生。重要的是，這些基因的惡性突變通常會導致腫瘤細胞轉移，保護癌細胞免于凋亡，并使它們對常見的癌癥療法更具有抵抗性。因此，研究發現這些突變使癌細胞對鐵死亡更加敏感，不僅使這些突變成為誘導鐵死亡治療的潛在生物標志物，而且揭示了這些惡性腫瘤細胞中不尋常的致命弱點，并為通過誘導鐵死亡治療癌癥提供了獨特的機會。對目前缺乏有效療法的胃癌和間皮瘤來說，這個機會極具吸引力。
1.4 潛在的誘導鐵死亡抗癌療法
目前正在積極開展以誘導鐵死亡為基礎的癌癥治療。雖然檢測了多種基于非靶向納米顆粒的策略來向腫瘤細胞內輸送鐵、過氧化物和其他有毒物質來殺死腫瘤細胞。但是，多種調控鐵死亡的酶的發現使癌癥的靶向治療成為可能，最明顯的靶點可能就是GPX4，因為它在大多數癌細胞中都有表達，且對癌細胞的生存至關重要。然而，GPX4缺乏經典的小分子結合位點，而現有的GPX4抑制劑可以共價修飾GPX4和其他硒蛋白的硒代半胱氨酸殘基，這會導致特異性問題和潛在毒性。另外，這些抑制劑本身具有高活性，因此不能在機體內穩定存在，不過這個問題可以通過開發可在細胞內代謝轉化為其活性形式的掩蔽前藥物來解決。然而，主要的障礙是GPX4在各種外周組織中是必不可少的，如腎小管細胞和小鼠的某些神經元亞群，因此，靶向GPX4可能會產生嚴重的副作用。
與靶向GPX4不同的是，鑒于小鼠中Slc7a11敲除不會引起顯著病變，且SLC3A2和/或SLC7A11的表達與黑色素瘤和神經膠質瘤患者的臨床預后呈負相關，通過抑制Xc系統限制細胞內（半）胱氨酸含量的方法極具前景。事實上，在小鼠模型中通過藥理學或遺傳學抑制Xc系統來阻止各種癌癥發生和轉移，已取得了很好的研究結果，與正常組織相比，腫瘤對Xc系統的抑制更加敏感，這可能是因為腫瘤細胞中更加活躍的代謝和其他變異使其處于持續的氧化應激，從而更容易依賴于Xc系統來緩解ROS毒性。顯然，利用基于抑制Xc系統這一抗癌療法前，需要檢測患者腫瘤組織中Xc系統的關鍵以因子或其他生物標志物的表達并進行分類。如SLC7A11過表達可能表示癌細胞更依賴于胱氨酸來清除ROS，而這些生物標志物決定了腫瘤細胞對抑制Xc系統的敏感性。
與SLC7A11基因敲除類似，敲除FSP1基因不會導致胚胎死亡或者出現明顯的病理變化，這表明靶向FSP1有望治療癌癥。此外，FSP1在多種癌細胞系中高表達，且在860種癌細胞系篩選中發現，FSP1是介導GPX4抑制劑抗性相關基因中排名最高的基因。GPX4缺失的癌細胞可以被FSP特異性抑制劑iFSP1有效清除，而在表達GPX4的癌細胞中，iFSP1可與RSL3協同誘導癌細胞鐵死亡。因此，FSP1抑制劑可能會進入臨床治療，特別是針對治療耐藥性腫瘤或者表現去分化特征的腫瘤。
基于鐵死亡誘導的抗癌療法也可能與其他治療方法相結合，例如與免疫檢查點阻斷治療和放射治療結合。與其他能夠誘導腫瘤組織中的免疫原性細胞死亡治療結合使用可以增強免疫檢查點的阻斷效果，因此免疫檢查點阻斷治療與其他治療方法的結合療法一直被積極研究。有意思的是，Zou等人發現抗PDL1抗體和免疫檢查點阻斷治療相結合可以增強鐵死亡誘導療法的效果。他們發現抗PDL1抗體可以刺激CD8+ T細胞分泌IFNγ，IFNg隨后引起腫瘤細胞Xc系統兩個亞基的下調，從而使癌細胞對鐵死亡敏感。因此，免疫治療聯合誘導鐵死亡是一種很有前景的治療方法，因為這兩種治療方法可以相互促進，達到協同抗癌的效果。關于放射療法，最近有研究發現，輻射本身可以誘導鐵死亡，也可以與鐵死亡誘導劑和免疫治療協同作用，這提供了一種有效抗癌的聯合治療方案。這種方法的抗癌效果在細胞死亡水平、脂質過氧化水平、鐵死亡相關基因表達變化和脂質組學變化方面、以及在細胞系、來源于患者的異種移植癌癥小鼠模型和離體的患者神經膠質瘤細胞培養中均有體現。此外，有研究發現細胞質輻射(而不是核輻射)與鐵死亡誘導劑具有協同抗癌作用，這提示在鐵死亡中，輻射通過消耗GSH和誘導脂質過氧化的方式來促進細胞死亡，而不是通過經典的DNA損傷作用。
另一方面，放射療法和免疫治療聯合療法也能提高癌細胞對鐵死亡的敏感性，其中，輻照與免疫治療通過DNA損傷激活的ATM激酶和IFNγ協同降低SLC7A11水平。最后，已有研究證明放射治療可以上調癌細胞中ACSL4水平。因此，由輻射誘導的鐵死亡效應可能由多種機制介導，且依賴于胞內環境。但值得注意的是，鐵死亡也被報道與一些由放射治療引起的不良反應有關，如肺纖維化以及粒細胞-巨噬細胞造血祖細胞的死亡。
2.缺血-再灌注損傷（IRI）與鐵死亡
缺血后再灌注可在受累器官中誘發大規模的細胞死亡和炎癥反應，導致包括腦中風、缺血性心臟病和肝腎損傷在內的重大疾病。值得注意的是，缺血性心臟病仍然是全球致死率最高的疾病。如下所述，有強力證據表明，鐵死亡是IRI相關細胞死亡的主要誘因，這至少部分是由缺血引起的氧化應激所致。這些發現表明抑制鐵死亡是一種治療缺血性損傷相關疾病的潛在治療方法。
2.1 鐵死亡對大腦及心臟的影響
多項研究已證實鐵死亡在神經毒性和腦損傷中的作用，提示抑制鐵死亡具有治療潛力。大鼠海馬切片培養的離體實驗表明，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1可阻斷谷氨酸誘導的神經元興奮毒性細胞死亡。由于谷氨酸誘導的神經毒性與腦卒中和各種神經退行性疾病有關，且高濃度的胞外谷氨酸可以通過抑制Xc-系統功能誘導鐵死亡，因此鐵死亡可能是這些腦類疾病的發病機制之一。遺傳學研究一致證實，小鼠條件性缺失Gpx4會引起類似神經退行性病變的癥狀。此外，在不同實驗體系中，鐵離子螯合劑和親脂RTAs被用來測試對中風及神經退行性病變的改善。雖然全身使用鐵螯合劑的副作用仍然是一個嚴重的問題，但這些實驗證實了鐵死亡在這些疾病中的重要作用。
在缺血性心臟病中，鐵死亡的作用也得到了廣泛的研究。在模擬小鼠心臟缺血再灌注損傷的體外系統中，研究表明鐵離子螯合劑和谷氨酰胺分解抑制劑能顯著減少心肌細胞死亡，緩解心臟組織損傷并改善其功能，提示了靶向鐵死亡在治療缺血性心臟病上的潛在價值，且最近的小鼠模型體內研究中也進一步證實了這一觀點。
為了設計可行的鐵死亡靶向療法來治療中風和缺血性心臟這樣的致命疾病，需要考慮許多重要因素。例如，這兩種疾病都是非常急性的，只允許短時間內進行干預，因此，需考慮鐵死亡靶向治療能否及時應用，從而足夠迅速地發揮其效果？此外，由于鐵死亡有多種代謝途徑，缺血再灌注可能通過選擇性地破壞特定監控途徑在不同器官中誘發鐵死亡，因此我們能否開發出特異性的鐵死亡抑制劑，可以有效地治療某種疾病，而對其他器官的副作用達到最小？
2.2 鐵死亡在與器官移植相關的缺血-再灌注損傷中的作用
除了大腦，在成年哺乳動物中，腎臟可能是對鐵死亡最敏感的器官；近端腎小管細胞的存活依賴于功能性GPX4，這些細胞在腎移植發生IRI時處于高風險。
在缺血-再灌注損傷小鼠模型、Gpx4全身敲除小鼠和葉酸誘導急性腎損傷小鼠模型中，鐵死亡抑制劑已被證明可以減輕腎小管細胞死亡和急性腎功能衰竭。這些研究表明，鐵死亡會促進某些特定分子改變相關的壞死性炎癥，導致固有免疫系統的激活。肝臟是另一種常見的移植器官，肝細胞特異性Gpx4敲除小鼠出生不久即會死亡，但高水平的維生素E飲食可以彌補肝臟中GPX4的缺乏，使小鼠存活。此外，Liproxstatin-1（一種強效鐵死亡抑制劑）可以保護肝實質組織免受缺血再灌注損傷。同時，鐵死亡也與心臟移植有關。總的來說，鐵死亡抑制劑可能是有助于各類器官移植成功的有效藥物。
2.3 缺血再灌注損傷的潛在治療靶點
在鐵死亡代謝網絡中存在多個潛在的治療干預靶點，但在干預措施的每個節點都有其自身的風險和優勢。考慮到鐵死亡是由磷脂過氧化作用驅動的，那么其中一種策略就是引入阻止過氧化進程的藥物。例如，可以使用親脂性RTA（如liproxstatin 1）來防止脂質過氧化自由基的擴散。這類藥物在鐵死亡的細胞模型中非常有效，在某些體內環境下也是有效的，然而在考慮人體試驗之前，還需要進一步改進其藥理性質。
阻斷脂質過氧化的第二種策略是抑制驅動脂質過氧化的酶或耗盡不穩定的鐵，例如，通過使用鐵螯合劑。鐵螯合劑已在許多臨床適應癥探索，但仍存在選擇性和安全性問題亟待解決。另一方面，靶向負責產生PUFA-PL和PLOOH的酶，如ACSL4、LPCAT3、LOXs和POR，可能是可行的。并且這些酶類作為已知的分子靶標，很適合以靶點為核心的藥物研發，然而它們在不同組織中還具有其他功能，這會使潛在的治療結果復雜化。
討論
鐵死亡能夠將鐵，硒，氨基酸，脂質和氧化還原化學等細胞代謝中迥然不同的元素聯系成一個整體網絡（圖5），這個網絡在正常生理以及多種病理等廣泛的生物學過程中發揮著重要作用。從我們目前掌握的資料來看，我們可以概述一下這個領域內中存在的問題、面臨的挑戰以及對潛在預期成果的展望。
該圖描述了與鐵死亡跨學科領域相關的一系列領域，以及與鐵死亡相關的一些疾病。漩渦代表與鐵死亡有關的疾病：轉移性癌癥、耐藥癌癥、腫瘤抑制，神經退行性病變、缺血性器官損傷、心臟損傷和器官移植等。氧化還原生物學、硒、鐵、脂質和氨基酸代謝(流)從不同方面影響鐵死亡。
首先，討論大家都擔憂的情況。盡管人們對鐵死亡的概念及其與生物學各個方面的相互聯系充滿研究熱情，但必須小心謹慎地嚴格測試鐵死亡在生物過程中的作用。單用一種鐵死亡抑制劑抑制細胞死亡不能作為鐵死亡參與某些過程的充分證據。目前對鐵死亡的定義是鐵耗竭和親脂性 RTA 抑制的細胞死亡過程，例如 ferrostatin-1、liproxstatin-1、維生素 E 或 CoQ10。 這兩方面都至關重要，因為存在不同于鐵死亡的鐵依賴性致死機制，例如可能涉及溶酶體毒性，以及獨立于鐵的氧化應激機制。我們建議增加另一項要求：直接檢測脂質過氧化(使用LC-MS/MS，熒光染料，或抗體，如1F)。最近報道的另一個潛在的標志物是TfR1的動員和上調。雖然其普遍性還有待確定，但這一新的標記可以區分氧化應激和鐵死亡。其他的鐵死亡標記對這一領域具有很高的價值。另一個值得關注的問題是在鐵死亡研究中使用的各種不恰當的實驗方法，這在任何新興領域都是一個不可避免的問題。為了解決這個問題，Box-2和Box-3提出了一個關于鐵死亡研究的實用指南，描述了在體內和體外研究鐵死亡需要考慮的因素。特別地，我們列出了一些在文獻中經常出現但在未來的研究中應該避免的不恰當的工具和方法。
其次，討論目前遇到的主要挑戰。盡管在理解鐵死亡調控機制方面取得了相當大的進展，但我們仍然不知道細胞最終是如何死亡的。目前確定的最下游步驟是PUFA-PLs的失控過氧化，過氧化的磷脂有可能造成膜損傷甚至膜穿孔，從而損害膜的完整性。然而，最近的研究發現，含有兩個PUFA尾的磷脂對于驅動鐵死亡效果較好，這表明脂質交聯可能是鐵死亡膜損傷的原因之一。在這種情況下，脂質交聯導致的膜組分流動性受限可能會導致一些膜相關的重要功能的喪失，從而導致細胞死亡(類似于在體內看到的血管硬化)。當然，還存在其他的可能性，比如PUFA-PLs氧化分解成活躍的親電分子，然后破壞其他大分子。在這個模型中，活躍的親電分子在鐵死亡中起的作用和caspase在細胞凋亡中的作用類似—使細胞內的關鍵結構和功能蛋白失活。我們希望在未來幾年內能明確闡明鐵死亡導致細胞死亡的具體機制。
最后，我們預測了未來在鐵死亡領域的一些潛在預期成果。精確鑒定鐵死亡的體內生物標記，類似于用剪切型Caspase 3來指示細胞凋亡的作用，對于確定這種細胞死亡模式的生理功能和治療潛力至關重要；找到能夠在非病理學背景下觸發鐵死亡的潛在自然誘導劑或生理信號仍然是一個燃眉之急，相信可能會在未來幾年取得突破。一些分子如谷氨酸、p53、鐵、輻射和PUFA-PLs可能被認為是（或接近于）誘導鐵死亡的病理生理觸發物。谷氨酸是一種含量豐富的神經遞質，過量的細胞外谷氨酸足以抑制system Xc–功能從而導致鐵死亡。自然狀態下，細胞外谷氨酸的這種作用可能被用來在發育或其他生理環境下誘導鐵死亡，比如在神經回路的形成過程中消除不必要的神經元。腫瘤抑制劑p53能誘導鐵死亡從而抑制腫瘤發生，在存在基底脂質過氧化物損傷的情況下誘導p53可能是一種通過鐵死亡清除應激態細胞的自然方法。在不同的模型系統中，高水平的鐵本身可以觸發鐵死亡，這就表明在某些情況下，釋放鐵蛋白儲存的鐵或增加鐵的輸入可能是通過鐵死亡清除細胞的一種手段。低到中等劑量的電離輻射已被證明可以誘導鐵死亡。在高劑量輻射或細胞的輻射保護性機制被破壞的情況下，可能會自然誘發細胞鐵死亡。考慮到輻射水平，也有人猜測，火星上可能曾經有過生命，但由于星球表面的強烈輻射，生命消亡了或者轉移到了地下。因此，可以推測，鐵死亡是所有生命固有的，需要不斷與之對抗——通過建立抗鐵死亡機制網絡，使生命得以生存和進化。抑制這些保護機制則是驅動鐵死亡的自發性誘因。最后，在某些情況下，PUFA攝取和PUFA-PL合成可能足以誘導鐵死亡，這種情況下，細胞會受到胞外環境中的PUFA（例如其他細胞或病原體釋放出來的）誘導而死亡，或受到刺激后促進PUFA-PL合成酶類（LPCAT3和ACSL4）的表達，誘導細胞死亡。這其中的一些機制可能參與了組織大小的發育調控、腫瘤抑制或免疫系統對受感染細胞的清除。
總而言之，有許多可以預見的機會可用來闡明鐵死亡的發生機制以及其自然用途。這些研究將擴展鐵死亡在生理和病理下功能的廣度。
box1 ：與鐵死亡相關的疾病
除了癌癥和缺血性器官損傷，鐵死亡與越來越多的其他疾病的發病機制有關，如神經退行性疾病、肝和肺的纖維化、自身免疫疾病、結核分枝桿菌誘導的組織壞死、吸煙相關的慢性阻塞性肺病以及罕見的遺傳性神經疾病Pelizaeus–Merzbacher。雖然這些例子說明了鐵死亡調控療法具有臨床意義和治療潛力，但鐵死亡是否是這些疾病的致病因素，還需要進一步研究。如：在大多數情況下疾病組織中發生非凋亡性細胞死亡，而鐵死亡抑制劑（通常是親脂性RTA）可以緩解這種細胞死亡，并在某些情況下改變病情的嚴重程度。然而，脂質過氧化物可以調節免疫和炎癥，而上述所列舉的疾病都與免疫和炎癥密切相關。因此，需要仔細區分親脂性RTA是通過調節炎癥還是鐵死亡來發揮作用，或者二者皆有。進一步研究細胞死亡相關機制，包括檢測體內特異性鐵死亡生物標志物（這方面研究目前很缺乏），將是闡明鐵死亡在疾病中作用的關鍵。
box2 ：鐵死亡誘導模型使用中的潛在問題
細胞對鐵死亡的敏感性不可避免的與其胞內和胞外的氧化還原狀態有關。例如，由于培養基中缺乏半胱氨酸，在許多細胞系中都存在system Xc–亞基SLC7A11的表達上調，在離體培養的細胞和器官中該亞基的表達則會被快速誘導。在小鼠中，機體對Slc7a11敲除具有很好的耐受性，因為半胱氨酸會以還原態形式存在于體內，并被中性氨基酸轉運蛋白吸收到細胞中，而在體外培養時幾乎所有表達system Xc–的細胞系在敲除SLC7A11后都是致死的，這是因為體外培養時，培養基中所有的半胱氨酸均以氧化形式存在。細胞培養和體內研究中顯著的氧化還原狀態差異使得對僅基于體外研究的結果進行解釋時要更慎重。同樣重要的是，當使用system Xc–抑制劑時，需要評估SLC7A11是否在待研究的細胞系中表達。令人擔憂的是，目前許多可用的抗SLC7A11的抗體都是非特異性的，不適用于確定SLC7A11的表達水平。
當干預GPX4的活性時，需要考慮GSH和其他含硫醇化合物甚至蛋白質硫醇都能夠作為GPX4的底物。因此，當利用鐵死亡誘導劑作用于（半）胱氨酸—system Xc–—GSH—GPX4軸的不同階段時，GPX4的底物廣泛性需要被特別考慮。值得注意的是，不同的血清含有不同含量的硒和維生素E。由于GPX4需要硒進行生物合成，而維生素E是一種能夠抗磷脂過氧化的有效抗氧化劑，不同的細胞培養血清可能會對實驗結果產生巨大影響。這個問題在使用Gpx4敲除小鼠時也存在，因為小鼠食物中維生素E含量（生育醇和生育三醇）可能有所不同，從而對Gpx4敲除小鼠的表型產生重要影響。因此，在今后的研究中，在使用病理模型或異種腫瘤移植時也應考慮到這一點。與此一致的是，在某些情況下補充硒和維生素E已經被證明可以促進癌癥。
box3：使用藥理學工具檢測鐵死亡時的相關實驗考量
小分子工具對檢測鐵死亡很有價值，然而，在使用這些工具時，必須考慮一些涉及特異性、生物學相關性、藥代動力學和藥效動力學的問題。首先，當使用某種酶的藥理抑制劑來評估該酶是否調控鐵死亡時，需要確定該抑制劑本身是否是一種親脂自由基捕獲型抗氧化劑，從而具有不依賴于酶反應的鐵死亡抑制效應，例如在一些涉及脂加氧酶抑制的研究中就存在類似問題。其次，需要在使用的實驗體系中驗證給定的小分子探針是否會影響所研究的靶點或途徑。例如，在使用RSL3抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）或使用erastin抑制system Xc–胱氨酸/谷氨酸反向轉運體時，必須使用生化分析或相應靶點抑制的藥理學標志物來檢驗實驗設置中的探針是否確實抑制了這些靶點。此外，當在動物實驗中使用小分子化合物時，首先需要確定合適的試劑配方和給藥途徑，以在靶組織中達到有意義的藥代動力學特征和藥效學反應。由于溶解性、穩定性和/或藥代動力學較差，許多在細胞實驗中效果好且特異性高的小分子探針在動物模型中無法應用。一些常見的方法是不合適的，并且應該避免的，在下面簡單列舉：
RSL3溶解度低，在小鼠體體內難以測定藥代動力學，這限制了其在組織或腫瘤直接注射時的適用性；erastin，同樣具有低溶解度和低代謝穩定性[值得注意的是，其衍生物咪唑酮erastin（IKE）具有良好的溶解性、高穩定性，在小鼠中具有良好的藥代動力學和藥效學，并已在體內研究中得到驗證]；ferrostatin-1也不適用于體內研究，而liproxstatin-1和維生素E可以在體內用作鐵死亡的抑制劑。
在體內實驗中，使用鐵離子螯合劑作為鐵死亡抑制的唯一手段而獲得的數據也應謹慎處理，因為耗盡鐵除了抑制鐵死亡外，還可能導致其他后果，且目前尚不清楚某些特定的結果是由于鐵離子被螯合還是由于化合物脫靶效應所導致的。通過在培養基中添加鐵（鐵或亞鐵）誘導或增強培養細胞鐵死亡并不適用于鐵死亡機制的研究，這是因為游離的鐵離子遇到氧和微量脂質過氧化物（由細胞意外死亡或其他誘導劑觸發的鐵死亡產生）時會催化Fenton鏈式反應，從而放大胞外脂質過氧化作用并迅速殺死細胞。
題外話
在這篇綜述發表不久后，美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的甘波誼教授團隊在 Nature雜志發表題為“DHODH-mediated ferroptosis defence is a targetable vulnerability in cancer的文章，提出了獨立于經典的GPX4信號通路的鐵死亡抑制因子DHODH（二氫乳清酸脫氫酶），可以說DHODH, FSP1和GPX4在細胞中形成了三足鼎立之勢來共同防御鐵死亡。最近幾年，有關鐵死亡的研究如同雨后春筍一般涌現，鐵死亡作為新興的領域，相信未來也會有更多相關的研究出現，這對闡明鐵死亡的機制具有重大意義。最后，小編想說，搞科研要與時俱進，緊跟熱點，不斷更新自己的知識儲備，才能迸發出更好的科研思路。
