欧美日本成人_亚洲一区二区日本_国产污视频在线观看_先锋影视av_99视频+国产日韩欧美_黄页视频在线免费观看_天海翼av在线播放_在线视频精品免费_黄色一级片免费在线观看_国内精品久久久久久久_av动漫网站_日本a级大片

細胞軌跡分析是單細胞研究中一個常用的手段，今天給大家分享一篇今年三月份發表在Cellular & Molecular Immunology（8.484）上的一篇利用單細胞轉錄組數據，確定正常個體中自然殺傷細胞分化軌跡，揭示骨髓殺傷細胞的異質性以及急性髓系白血病患者中NK細胞的應激特征的文章——Single-cell profiling reveals the trajectories of natural killer cell differentiation in bone marrow and a stress signature induced by acute myeloid leukemia

單細胞分析揭示了骨髓中自然殺傷細胞分化的軌跡和急性髓系白血病誘導的應激特征

一、研究背景

自然殺傷細胞是機體重要的免疫細胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，參與殺死受感染的細胞或者腫瘤細胞。正常人類骨髓中的殺傷細胞可以分為兩種——NK1 CD56^dim CD16⁺、NK2 CD56^bright CD16^- 。其中CD56^dimNK1細胞表現出高的毒性，而CD56^bright NK2 涉及趨化因子和細胞因子的分泌。

一些研究表明，NK2細胞可以發展為NK1細胞。在造血干細胞遷移后不久，NK2細胞構成主要的自然殺傷細胞群，而在隨后3個月，伴隨CD56^dim NK1細胞水平的升高，CD56^bright NK2細胞逐漸消失。而急性髓系白血病（AML）是一種血液系統的惡性腫瘤，AML患者的NK細胞表現出低水平的細胞表面NCR表達，這與細胞毒性受損有關。作者使用8名健康人類骨髓中的NK細胞，探究人類骨髓NK細胞異質性及其分化軌跡，以及8名AML患者的NK細胞探究其與正常個體NK細胞的差異，從而分析NK細胞是如何影響腫瘤發展的。

二、數據及方法

10X的基因組高通量的scRNA-seq數據：

來自8名健康捐贈者骨髓的約24000個NK細胞

來自8名AML患者骨髓的約15000個NK細胞

樣本數據;

來自TCGA的161個AML患者的臨床數據及表達數據

三、研究的主要內容及結果

1、高通量的單細胞RNA-seq方法識別人類骨髓中NK細胞

使用高通量scRNA-seq測序八名健康捐贈者的骨髓細胞，經流式細胞術分類獲取24000個NK細胞。使用gene signature的module score 分析，去除了10個受污染的ILC細胞(圖1A)。接下來，通過UMAP分析將NK細胞聚為4個不同的亞群。其中hNK_Bm4亞群只存在2、3、5號患者細胞（圖1B,C,D)。識別hNK_Bm4亞群和其他三個亞群NK細胞的139個差異表達基因，其中88個下調基因和51個上調基因（圖1E）。下調基因對于NK細胞的發育和分化至關重要，而上調基因參與編碼NK細胞相關效應蛋白和細胞成熟（圖1E）。GO功能分析表明hNK_Bm4亞群富集于NK細胞效應功能，例如，NK細胞介導的細胞毒性和凋亡信號（圖1F）。

2、人類骨髓中存在三種NK細胞亞群

從所有細胞中刪除hNK_Bm4細胞亞群，進一步描述供者之間骨髓NK細胞的異質性(圖2A)。識別hNK_Bm1、hNK_Bm2、hNK_Bm3三個亞群的轉錄組特征差異255個基因，繪制三個亞群細胞的熱圖(圖2B)，通過無監督的層次聚類分析并沒有觀察到顯著的個體特異性和批次效應。在PCA分析中，來自特定個體的NK子集沒有聚集在一起，并由此得到三個亞群的驅動基因(圖2C,D)。根據每個亞群中，基因表達水平的高低，提取全基因集中、編碼分泌蛋白、細胞膜標記物和轉錄因子基因集中top10的基因，確定每個亞群的特征。功能富集分析每個亞群參與的生物學通路，進一步揭示3個亞群的轉錄特異性(圖2E,F)。

3、三種NK細胞亞群包括一個類NK1-CD56^dim亞群，一個類NK2-CD56^bright亞群和一個額外的類CD56^bright亞群

比較確定的三個亞群和以往的NK細胞分型之間的關系，通過gene signature 熱圖和模塊評分分析（圖3A,B,C），以及流式細胞術和不同基因的表達情況（CD160 、CD52、CD122、CD27和CD69）（圖3D,E,F）。確定hNK_Bm1和hNK_Bm2亞型分別類似于NK1-CD56^dim和NK2-CD56^bright亞型，它們也存在于人類的血液和脾臟中。第三種亞型 hNK_Bm3存在于脾臟而不是血液中，與組織亞型hNK_Sp3最接近。

4. 確定NK細胞分化軌跡的起點——NK0子集

為了探究前面確定的4個NK細胞亞群是否反映了NK細胞不同的成熟狀態，作者通過KLRC1基因、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因KIR2DL3和KIR3DL1的表達，確定了hNK_Bm1亞群比hNK_Bm2和hNK_Bm3亞群更成熟，因為細胞表面NKG2A表達的減少和伴隨的KIR表達的增加與人類NK細胞的分化有關（圖4A,B,C）。應用偽時序算法Monocle DDRTree尋找骨髓NK亞群的發育路徑，4個亞群的偽時序軌跡與先前UMAP定義的亞群完美重疊，為我們之前的結論提供了額外的支持。(圖4D)

通過NK前體細胞（NKP）基因特征，確定假定的發育軌跡的起點（圖4E）。模型評分分析比較骨髓NK細胞亞群中NKP和成熟NK細胞基因的特征(圖4E, F)，hNK_Bm3亞群表現出NKP特征的特異性富集，而成熟的NK細胞中富集hNK_Bm1和hNK_Bm4亞群(圖4E, F)。NK基因簽名模塊評分的小提琴圖也顯示hNK_Bm3亞群為最不成熟的細胞亞群(圖4G)。因此，hNK_Bm3子集被定義為偽時間發展軌跡的起點，分別沿著NK1-CD56^dim-like hNK_Bm1亞群和NK2-CD56^bright-like hNK_Bm2亞群兩個不同的發育途徑。hNK_Bm4是自適應NK細胞亞群，出現在hNK_Bm1亞群之后的一個時間點(圖4H)。

除了骨髓，作者最近開發的偽時間算法Monocle DDRTree重新分析了之前的脾臟數據(圖4I)。hNK_Sp3子集被認為是最不成熟的，hNK_Sp2、hNK_Sp1和hNK_Sp4子集依次更加成熟(圖4J)。因此，我們將CD56bright-like hNK_Bm3和CD56bright-like hNK_Sp3子集稱為NK0。

5. 急性髓系白血病影響人骨髓NK細胞的轉錄組

急性髓系白血病(AML)是一種與NK細胞功能嚴重受損相關的特殊骨髓疾病。UMAP分析來自8例AML患者的約15000個骨髓NK細胞，存在11個NK細胞亞群(圖5A)，這些亞群具有很強的患者間異質性——相同患者來源的細胞聚在一起(圖5B)。使用模塊評分分析以及基于蛋白質水平檢測12名AML樣本和7名健康人類的NK細胞中CD56bright和CD56dim亞群的百分比的異質性(圖5C)，表明AML強烈影響骨髓NK細胞的轉錄組譜。

因此，我們通過分析來自健康捐贈者和AML患者的骨髓NK細胞混合物，進一步研究AML對骨髓NK細胞的影響。對38700個骨髓NK細胞進行UMAP分析顯示，NK細胞聚集存在差異(圖5D)。AML供體來源的NK細胞的107個表達上調基因，包括干擾素誘導基因，HLA分子編碼基因，編碼控制NK細胞成熟和存活。相比之下，健康供者來源的NK細胞的90個基因表達上調顯示出更高水平的NK細胞效應分子基因，表面受體基因(圖5E)。以及健康供體骨髓NK細胞中CD160的表達水平高于AML供體骨髓細胞(圖5F)。來自TCGA數據庫的AML患者中，CD160高的AML患者的生存率遠高于CD160低的腫瘤患者，提示CD160是AML中的抗腫瘤生物標志物(圖5G)。

相對于健康個體的骨髓NK細胞，AML患者的骨髓NK細胞富集在細胞因子應答和I型干擾素信號通路上(圖6A)。相比之下，從健康骨髓中純化的NK細胞富集在NK細胞介導的細胞毒性、FcγR信號通路、胞外分泌、IL-12和IL -15介導的信號通路應答。總的來說，健康個體來源的NK細胞比AML患者中分離的NK細胞具有更活躍的表型，顯示出強烈的I型IFN反應特征。這個結論，也在磷酰十四酸酯和離子霉素的模擬實驗中得到驗證(圖6B)，并進一步擴展了對NK細胞轉錄組譜的功能分析(圖6C)。

四、結論：

本篇文章從單細胞轉錄組的角度，探討健康個體以及AML患者中，來自人類骨髓中NK的異質性。作者首先在來自8名正常人類骨髓的NK細胞中，確定了4種不同的NK細胞亞群，其中hNK_Bm4亞群有明顯的患者特異性。而hNK_Bm1, hNK_Bm2, hNK_Bm3亞群存在所有的正常個體中；并確定了這些NK細胞亞群的分化軌跡。最初鑒定為hNK_Bm3的細胞亞群，高表達CD56、CD52和CD127，且CD160表達較低，不存在于人類血液中，作為NK細胞分化的起點。通過比較AML中NK細胞和正常個體中的NK細胞，確定了AML患者中NK細胞的特異性，以及一個和AML預后顯著相關的重要標記——CD160。