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嗨，早上好呀，相信經過持續關注，大家已經對細胞衰老有所了解。今天給大家分享一篇2022年1月份發表在風濕病Top級別期刊的文章，Ann Rheum Dis（Q1，IF=19.103）。

METTL3介導的ATG7 m⁶A修飾調節自噬-GATA4軸促進細胞衰老和骨關節炎進展

摘要

本研究旨在探討成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS）及其衰老在骨關節炎（OA）進展中的作用和調節機制。在患者和小鼠模型中，隨著OA的進展，衰老的FLSs顯著增加。作者確定OA-FLS中發生自噬受損，導致衰老相關分泌表型（SASP）上調，自噬的重建通過抑制GATA4逆轉衰老表型。此外，作者首次觀察到過度m⁶A修飾對OA-FLS中的自噬產生負性調節。該研究揭示了FLS衰老在OA進展中的重要作用。在實驗動物模型中，靶向METTL3抑制可以緩解FLS的衰老，限制OA的發展，為OA治療提供了一種潛在的策略。

背景

骨關節炎（OA）是晚年最常見的關節疾病，其主要特征是軟骨基質逐漸喪失，并伴有其他關節成分的病理變化，包括軟骨下骨硬化和滑膜炎癥。據報道，偶發癥狀性膝關節骨性關節炎在55至64歲之間達到高峰。在老年人中，多種與衰老相關的因素可能有助于OA的發展。線粒體功能障礙、氧化應激和自噬減少改變軟骨細胞功能，促進分解代謝過程和合成代謝過程中的細胞死亡。因此，提高對衰老如何促進OA進展的理解，將為減緩或停止OA提供新的策略。衰老細胞的長期存在與組織功能喪失和OA等與年齡相關的慢性疾病密切相關。細胞衰老是衰老的重要標志，軟骨細胞在衰老和OA進展過程中具有衰老細胞的各種特征。據報道，在OA的發病機制中，大量滑膜細胞衰老。關節軟骨細胞依賴自噬作為維持正常功能和存活的主要機制。在衰老過程中，軟骨細胞中的自噬逐漸減少，從而導致衰老，最終導致OA嚴重程度加重。然而，OA進展中自噬受損的機制尚不清楚。

N6-甲基腺苷（m⁶A）作為一種廣泛的RNA轉錄后修飾，決定信使RNA（mRNA）的穩定性、剪接、運輸、定位和翻譯效率，深入參與各種細胞過程，包括DNA損傷、自噬和細胞衰老。最近，有報道稱，m⁶A甲基轉移酶的核心成分甲基轉移酶樣3（METTL3）在人類類風濕性關節炎滑膜中顯著升高。METTL3基因敲低可有效抑制成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS）中的炎癥和MMP因子表達。然而，m⁶A修飾的生物學意義以及FLS細胞衰老的潛在調節機制仍不完全清楚。

一句話總結現狀：衰老細胞的長期存在與骨關節炎（OA）的發展密切相關，但潛在的機制仍不清楚。

在這項研究中，作者首次在體外和體內證明了衰老FLS在OA進展中的關鍵作用，并發現m⁶A修飾與FLS衰老之間存在正相關。METTL3以m⁶A-YTHDF2依賴的方式影響自噬相關7（ATG7）mRNA的穩定性，從而影響自噬活性，進而促進FLS衰老和OA進展。

材料方法

作者收集正常和OA患者的滑膜組織，通過免疫熒光和免疫印跡分析滑膜FLS的衰老；通過N6-甲基腺苷（m⁶A）-甲基化RNA和RNA免疫沉淀分析，探討了甲基轉移酶樣3（METTL3）在自噬調節中的作用；對進行內側半月板（DMM）手術的小鼠進行關節內注射pAAV9（含有靶向METTL3的小干擾RNA（siRNA））或不注射pAAV9，進行組織學分析以確定軟骨損傷。

結果

FLS衰老和自噬受損與OA的進展密切相關

為了探索細胞衰老在OA發展中的作用，作者首先檢測了人類OA患者滑膜組織中衰老細胞的典型生物標記物p16^INK4a和p21的表達。OA患者滑膜中二者的蛋白質和mRNA水平顯著升高（圖1A-D）。作者進一步觀察了OA滑膜組織中衰老FLS的積累和表型特征，p16^INK4a和FLS標記物波形蛋白的雙陽性免疫染色證實了這一點（圖1E）。OA患者滑膜中自噬小泡的積聚減少，表明OA滑膜中自噬不足（圖1F）。通過DMM建立了創傷后OA模型，作者發現與假手術小鼠相比，DMM小鼠滑膜中p16INK4a陽性FLS的數量以時間依賴性的方式顯著增加（圖1G）。軟骨降解和OARSI（Osteoarthritis Research Society International）評分隨時間顯著加重（圖1H），這與增強的FLS衰老密切相關（圖1I）。此外，作者還證明，在DMM誘導的OA進展過程中，LC3B的表達顯著降低（圖1J），這與OARSI評分呈負相關（圖1K）。這些結果表明FLS衰老和自噬受損與OA進展密切相關。

衰老的FLS有助于軟骨細胞在體內和體外的分解代謝作用

為了進一步驗證衰老的FLS是否能加速OA的病理進展，作者將人類軟骨細胞（C28/I2細胞）與OA患者的原代FLS（OA-FLS）或非OA患者的FLS（Con-FLS，圖2A）共同培養。有趣的是，在與OA-FLS共培養后，檢測到C28/I2細胞中MMP13和ADAMTS5的表達增加，II型膠原的表達減少（圖2B，C）。此外，為了進一步研究衰老的FLS對體內軟骨降解的影響，作者使用博萊霉素（一種DNA損傷化學劑）誘導小鼠FLS中的細胞衰老，然后未經DMM手術的小鼠關節內注射2.5×10⁵正常FLSs或博萊霉素誘導的衰老FLSs（圖2D）。在第一次注射后第56天，作者發現注射衰老FLSs的小鼠與注射正常FLSs的小鼠相比，safranin O染色減少，II型膠原表達降低（圖2E，F），同時滑膜和軟骨中p16^INK4a表達升高（圖2G，H）。這表明外源性注射衰老的FLS可引發軟骨功能障礙，并誘導滑膜和軟骨衰老。

OA患者和DMM誘導的OA小鼠的衰老FLS中的自噬受損

在OA和DMM小鼠模型患者中，FLSs中LC3B表達降低（圖3A、B）。p16^INK4a陽性細胞中的LC3B顯著降低（圖3C、D）。為了證實OA-FLS中自噬結構的減少是由自噬損傷還是自噬降解增強引起的，作者使用了自噬通量抑制劑巴非霉素，它可以通過防止溶酶體降解增加LC3B。巴非霉素處理增加了Con FLS中LC3B點狀細胞的數量，并提高了p62的水平。然而，巴非霉素治療并沒有增加OA-FLS中LC3B和p62的表達（圖3E，F），這表明OA-FLS缺乏進一步自噬體形成的能力，并且OA-FLS中溶酶體的降解能力已經處于較低水平。

FLS中受損的自噬以GATA4依賴性方式加速細胞衰老

為了評估自噬是否介導FLS衰老，作者進行了額外的自噬激活和阻斷實驗。一方面，雷帕霉素激活自噬有效增加了每個細胞的LC3B-II和LC3點狀蛋白質水平，并抑制了一系列事件，包括p16^INK4a、p21和p62的表達（圖4A）。另一方面，通過3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬可顯著降低LC3B-II水平，并伴有Con-FLS中p62、p16^INK4a和p21的表達升高（圖4B）。衰老調節劑GATA4在體內和體外OA-FLS中顯著增加（圖4C、D）。此外，在OA-FLS中通過雷帕霉素恢復自噬可有效降低GATA4的表達，而3-MA治療顯著提高Con-FLS中GATA4的蛋白水平（圖4A，B）。GATA4基因敲低減輕了3-MA誘導的p16^INK4a、p21和SASP的表達（圖4E、F）。相反，GATA4的上調可能有助于p16^INK4a、p21和SASP的表達（圖4G，H）。

升高的m⁶A水平與OA-FLS中的自噬受損相關

為了確定m⁶A修飾是否參與調節OA發展過程中FLS中的自噬活性，使用免疫熒光法測定m⁶A的水平。在OA患者和DMM小鼠模型的FLS中，m⁶A表達均顯著增加（圖5A-C）。鑒于m⁶A修飾主要受m⁶A甲基轉移酶復合物的調節，作者測量了OA滑膜和OA-FLSs中相關復合物的mRNA水平，除了METTL3的mRNA表達顯著上調，而其他基因的mRNA表達沒有顯著變化。從OA患者滑膜分離的FLS中METTL3的蛋白質水平也顯著升高（圖5D，E）。通過對人類OA滑膜和DMM誘導的OA模型中使用免疫熒光染色對波形蛋白和METTL3進行雙重標記，進一步證實了這一發現（圖5F，G）。METTL3的上調提高了m⁶A水平，伴隨著LC3B-II的表達降低，p62和GATA4的表達增強（圖5H）。相反，METTL3基因敲低降低了OA-FLS中m⁶A的水平，上調了LC3B-II的表達，并抑制了p62和GATA4的蛋白水平（圖5I）。這些結果表明，METTL3介導的m⁶A修飾在FLS中自噬調節的衰老中起關鍵作用。

METTL3介導的m⁶A修飾以YTHDF2依賴性方式誘導ATG7轉錄本的衰變

在人類OA-FLSs和DMM小鼠模型中，ATG7蛋白水平持續顯著降低（圖6A，B）。METTL3的上調顯著降低了ATG7的表達（圖6C）。相比之下，METTL3基因敲低上調了OA-FLS中ATG7的表達（圖6D）。ATG7的上調有效緩解了METTL3誘導的LC3B-II減少，并降低了Con-FLS中p62和GATA4的表達（圖6E）。ATG7的敲低也抑制了METTL3敲低誘導的LC3B-II增加，并提高了Con FLS中p62和GATA4的水平（圖6F），表明METTL3誘導的FLS自噬缺陷是通過抑制ATG7介導的。接下來，作者對ATG7轉錄本進行序列分析，發現編碼序列區內有三個m⁶A修飾位點，3′-非翻譯區（UTR）內有五個m⁶A修飾位點（圖6G）。m⁶A RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，m⁶A在位點1、2、4、5和7處顯著富集（圖6H）。與Con-FLS相比，OA-FLS中位點4和7的m⁶A富集顯著增加（圖6I），METTL3敲除后m⁶A富集顯著減少（圖6J）。這些結果表明METTL3靶向ATG7轉錄本，并以m⁶A依賴的方式調節ATG7。據報道，YTHDF1促進靶向m⁶A修飾mRNA的翻譯，而YTHDF2選擇性識別并破壞m⁶A修飾mRNA的穩定性。作者發現，YTHDF2基因的敲低顯著減輕了METTL3誘導的ATG7蛋白表達的降低，而并不影響ATG7蛋白的表達。這表明METTL3修飾ATG7的m⁶A mRNA是YTHDF2的靶點（圖6K）。此外，TG7與YTHDF2相互作用，但與YTHDF1無關（圖6L，M）。上述結果表明METTL3以YTHDF2依賴的方式調節ATG7的表達。

METTL3在體外調節細胞衰老和SASP表達

作者通過轉染METTL3質粒在人類FLS中過度表達METTL3，METTL3的上調顯著提高了人類FLS中p16^INK4a和p21的表達（圖7A，B）和SASP的mRNA水平（圖7B）。β-半乳糖苷酶分析也證實METTL3促進FLSs的衰老（圖7C）。而METTL3基因敲低明顯抑制了OA-FLS中p16^INK4a和p21的表達（圖7D，E），并降低了SASP的表達和IL-1β的分泌（圖7E）。另外，METTL3基因敲低可有效緩解博萊霉素誘導的小鼠FLS中p16^INK4a、p21和SASP的表達（圖7F），以及β-半乳糖苷酶的產生（圖7G，H）。總之，這些數據表明METTL3可能作為一個潛在的治療靶點來損害FLS的細胞衰老。

滑膜靶向METTL3抑制緩解了DMM小鼠模型中OA的進展

作者將編碼滑膜成纖維細胞靶向肽基序（HAP-1）的DNA序列插入VP2結構域的N-末端，以構建FLS靶向的腺相關病毒載體（rAAV9.HAP-1）（圖8A）。與rAAV9相比，rAAV9.HAP-1的轉染效率略有提高，在ATDC5細胞中檢測到低增強型綠色熒光蛋白（EGFP）表達（圖8B，C）。關節內注射AAV9.HAP-1-si-METTL3后，DMM小鼠在OA發育過程中進行性軟骨降解顯著逆轉（圖8D，E）。此外，與用AAV9.HAP-1-NC治療的小鼠相比，用AAV9.HAP-1-si-METTL3治療的小鼠滑膜中的METTL3和p16^INK4a水平顯著降低（圖8F）。這些結果表明，通過向滑膜的AAV9.HAP-1衣殼傳遞si-METTL3可以抵消DMM誘導的OA小鼠模型中的OA進展。

總結

本文的研究結果擴大了對METTL3在促進細胞衰老和OA進展中發揮基礎作用的機制的認識。METTL3通過調節自噬并以m⁶A-YTHDF2依賴的方式影響ATG7轉錄本的穩定性來實現這些功能（圖8G）。該研究強調了m⁶A甲基化機制在自噬中的功能重要性，這為了解METTL3調節細胞衰老的潛在分子機制以及OA治療策略的發展提供了見解。

寫在最后

這篇文章讀下來像是領略了一場細胞衰老和OA之間的“視覺盛宴”，在欣賞之余是否隱隱擔心這么復雜多樣的研究一定得耗費不少時間和精力吧，那有沒有更便捷的方式方法呢？當然有！動動手指聯系生信人，為你提供高效專業的服務。