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解析癌癥的致病機制并識別潛在的治療靶點越來越受到關(guān)注，那么該如何利用生信方法確定關(guān)鍵點，并與實驗結(jié)合完成一個完整的課題呢？小編今天給大家介紹的剛剛發(fā)表在J. Exp. Clin. Cancer Res（IF:12.658）雜志上結(jié)合單細(xì)胞及組織數(shù)據(jù)識別食管癌治療靶點的文章可能會給出答案。
Integrative analysis of bulk and single-cell gene expression profiles to identify tumor-associated macrophage-derived CCL18 as a therapeutic target of esophageal squamous cell carcinoma
組織及單細(xì)胞基因表達(dá)譜整合分析揭示來自腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的CCL18能夠作為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療靶點
一．研究背景
食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)排名第六的惡性腫瘤，其中超過90%的病例為食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)。此外，ESCC患者預(yù)后較差，5年生存率低于30%，且目前只有部分ESCC患者能夠從包括免疫治療在內(nèi)的治療策略中獲益。因此，迫切需要進(jìn)一步刻畫ESCC的腫瘤微環(huán)境、識別早期診斷生物標(biāo)志物并開發(fā)新的治療靶點。
二．文章摘要
該研究對食管鱗癌活檢樣本的組織及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，識別了與食管鱗癌預(yù)后和腫瘤發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞亞群和治療靶點。研究對84例食管鱗癌的腫瘤及配對的癌旁樣本的基因表達(dá)、功能富集和腫瘤微環(huán)境(TME)圖譜進(jìn)行了全面刻畫。此外，研究設(shè)計并篩選了針對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的趨化因子CCL18的阻斷肽，并利用自發(fā)性食管鱗癌小鼠模型驗證了CCL18阻斷肽的抗腫瘤活性。
三．文章的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. ESCC的分子特征與細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)
文章第一部分首先對ESCC的分子特征與細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行了介紹。研究的主要流程如圖1A所示，作者首先識別了ESCC腫瘤及癌旁樣本的差異基因(圖1B)，并對這些基因進(jìn)行了功能富集分析(圖1C，D)。接著研究基于之前的單細(xì)胞研究揭示了ESCC微環(huán)境的細(xì)胞亞群，其中包括上皮細(xì)胞(包括非惡性上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)、免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(圖2A)。接著研究使用CIBERSORTx基于從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷出的細(xì)胞類型表達(dá)特征來推斷組織測序數(shù)據(jù)中的細(xì)胞豐度(圖2B，C)。研究接著分析了食管鱗癌組織隊列中細(xì)胞類型的預(yù)后作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞與食管鱗癌患者不良預(yù)后相關(guān)(圖2D)。
2. ESCC TME中細(xì)胞通訊分析
這一部分研究對ESCC TME中的細(xì)胞通訊進(jìn)行了詳細(xì)分析。研究使用CellChat從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷細(xì)胞間的通信。研究主要分析了細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的上皮或腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用。研究首先分析了細(xì)胞互作的總數(shù)和顯著影響的細(xì)胞類型(圖3A和B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中互作的數(shù)目比癌旁高(圖3C)，且腫瘤中上皮及腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的信號傳導(dǎo)顯著增加(圖3D)。
接著研究聚焦于細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞和TME之間的相互作用。分析首先發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞標(biāo)志基因CCL5和GZMA，單核細(xì)胞標(biāo)志基因CCL3、CCL3L1和CCL4，巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因CCL18、GZMA和DC標(biāo)志基因GZMB等7個配體的表達(dá)上調(diào)，可能影響ESCC TME中細(xì)胞的浸潤和分布(圖4A)。接著觀察到CCR1在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，CCR5在T細(xì)胞和單核細(xì)胞中高表達(dá)，PITPNM3在上皮及腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)(圖4 A)。配體-受體相互作用分析還揭示了CCL3/CCR1/CCR5和CCL18/PITPNM3是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中最顯著的信號通路(圖4B)。研究進(jìn)一步觀察到上調(diào)趨化因子中，CCL18在腫瘤中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)(圖4C)，而CCL18的受體PITPNM3在上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)(圖4A)，并與不良預(yù)后相關(guān)(圖4D)。此外，CCL18-PITPNM3信號是上皮及腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間最強的相互作用(圖4E)。通過免疫熒光染色，研究證實CD68+巨噬細(xì)胞(主要是M1型巨噬細(xì)胞)中CCL18的表達(dá)高于CD206+巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)(圖4F)。隨后，研究分析了CCL18表達(dá)水平與ESCC患者的臨床病理特征的相關(guān)性(表1)，發(fā)現(xiàn)CCL18與腫瘤分期顯著相關(guān)。
3. CCL18作為ESCC潛在治療靶點的識別
這一部分研究分析了CCL18是否能夠作為ESCC的潛在治療靶點。研究首先分析了多種食管上皮細(xì)胞系中CCL18和PITPNM3的表達(dá)，結(jié)果如圖5A和B所示，研究選擇表達(dá)PITPNM3而不表達(dá)CCL18的食管癌細(xì)胞株EC-109進(jìn)行后續(xù)的體外實驗，結(jié)果如圖5C和D所示rhCCL18可以促進(jìn)EC-109細(xì)胞的增殖，且細(xì)胞克隆實驗也得到類似結(jié)果(圖5E)。接著研究分析了敲低PITPNM3對EC-109細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhCCL18可以促進(jìn)EC-109細(xì)胞的增殖，但對EC-109 shPITPNM3細(xì)胞沒有影響(圖5F和G)。此外，研究觀察到由rhCCL18介導(dǎo)的JAK2和STAT3磷酸化水平增強可被STAT3抑制劑S3I-201逆轉(zhuǎn)(圖5H)。
4. CCL18阻斷肽的設(shè)計與識別
這一部分研究對CCL18阻斷肽的設(shè)計與識別進(jìn)行了介紹。小鼠體內(nèi)沒有與CCL18相對應(yīng)的基因，研究發(fā)現(xiàn)CCL18與人CCL3之間的序列相似性為62.3%，與小鼠CCL3之間的序列相似性為56.52%(圖6A)，因此研究假設(shè)CCL3在小鼠中具有與CCL18相當(dāng)?shù)男?yīng)，因為人類CCL18與人類和小鼠CCL3表現(xiàn)出高度相似的序列和結(jié)構(gòu)(圖6B)。接著研究根據(jù)序列比對和結(jié)構(gòu)選擇了來自人CCL18和CCL3的潛在功能片段(圖6C)，從CCL18和CCL3的N端和C端選擇并合成阻斷肽Pep 1-4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pep3可以顯著逆轉(zhuǎn)rhCCL18對EC-109細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(圖6F)，而Pep1和Pep2只有在200 μM的高濃度下才有效(圖6D和E)。因此研究選擇Pep3作為CCL18抑制劑。
5. 阻斷肽Pep3在自發(fā)性ESCC小鼠模型中顯著抑制腫瘤生長
文章最后一部分在小鼠模型中對阻斷肽Pep3進(jìn)行了進(jìn)一步分析。研究首先建立自發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型(圖7A)，接著將自發(fā)性發(fā)生ESCC的小鼠隨機分為兩組，分別給予Pep3或溶劑，結(jié)果觀察到Pep3對ESCC小鼠的體重沒有明顯影響(圖7B)，但可以顯著延長小鼠的生存期(圖7C)。此外，Pep3處理顯著抑制了腫瘤的進(jìn)展，導(dǎo)致腫瘤的總長度直徑和數(shù)量都顯著減少(圖7D)，且對CD4+ T細(xì)胞的比例沒有影響(圖7E)。接下來研究也觀察到Pep3能夠減少巨噬細(xì)胞的總數(shù)，但對M1/M2巨噬細(xì)胞的比例沒有影響(圖7F)。研究也發(fā)現(xiàn)Pep3治療顯著限制了食管組織中的腫瘤發(fā)展(圖7G)。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。文章結(jié)合組織及單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，對腫瘤及癌旁樣本的基因表達(dá)和細(xì)胞相互作用進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)趨化因子和細(xì)胞因子在ESCC癌變過程中失調(diào)，進(jìn)而識別出腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的趨化因子CCL18能夠促進(jìn)腫瘤增殖，導(dǎo)致食管鱗癌預(yù)后不良，最終設(shè)計出能夠抑制CCL18促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞增殖的Pep3肽，并在食管鱗癌小鼠模型中進(jìn)行了驗證。文章在數(shù)據(jù)上整合了組織及單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，在方法上“干濕結(jié)合”，內(nèi)容充實，有理有據(jù)，令人信服，十分值得我們參考學(xué)習(xí)。
