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乳腺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤，關于乳腺癌的實驗千千萬，如何設計一個實驗，將原本平平無奇的研究與熱點研究深入挖掘，獲得意想不到的結論呢？來自重慶醫科大學第一附屬醫院的研究人員發表在Theranostics（IF：11.556）期刊上一篇旨在識別和表征一種可能與BrCa預后和治療反應相關的新的腫瘤抑制基因（TSG）的文章，下面一起來看看如何合理設計實驗以得出腫瘤抑制因子 DRD2觸發乳腺癌細胞焦亡的吧！
Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and
restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer
腫瘤抑制因子 DRD2 促進巨噬細胞的M1極化并抑制NF-κB 信號傳導以觸發乳腺癌細胞焦亡
一、研究背景
乳腺癌晚期診斷和復發是癌癥患者生存率低的兩大主要原因，但仍然缺乏有效的治療策略，而腫瘤抑制基因(TSGs)對腫瘤進展至關重要，這些基因通常被 BrCa 中的 DNA 甲基化下調和沉默。因此，本研究旨在識別和表征一種可能與BrCa預后和治療反應相關的新的TSG，從而進一步促進BrCa的綜合治療。
DRD2屬于多巴胺（DA）受體家族，是類D2受體中占主導地位的成員，越來越多的實驗表明，DA 能通過激活 DA 受體來抑制腫瘤生長和轉移，此外，DA受體通過參與腫瘤相關微環境(TME)的重編程來調控腫瘤的發展。然而DRD2 是否以及如何介導 BrCa 進展在很大程度上仍然未知。
因此，本文要解決的科學問題，就是回答DRD2是否是潛在的TSG及BrCa患者預后生物標志物；如果是，那么DRD2介導的腫瘤抑制作用的調控機制是什么？
二、結果
1、DRD2 通過 BrCa 中的啟動子甲基化被轉錄下調
為了研究新的潛在 TSG，研究人員使用 BrCa 組織和正常組織分析 RNA-seq 譜和在線數據庫（圖 1A-C）。結果表明與正常乳腺組織相比，BrCa 組織中 DRD2 的 mRNA 表達顯著下調。
緊接著，研究人員基于TCGA數據庫分析BrCa患者中DRD2表達及啟動子甲基化狀態與病理特征的關系。結果表明DRD2 被認為是潛在的 TSG，可以代替 DRD3 或 DRD4 進行進一步研究，具體結果如下：
1. DRD2的高表達與患者年齡呈負相關。
2. HER2 陰性患者的 DRD2 表達較高。
3. DRD2 甲基化增加在老年人群中更為常見。
4. 基于 Kmplot，DRD2 的更高表達促進了 BrCa 患者及其HER2陽性患者的更長生存期，但是在 Luminal A 患者中沒有看到這種優勢（圖1D）。
最后，根據 RT-PCR 和 MSP 結果，與永生化的正常乳腺細胞系相比，幾乎所有 BrCa 細胞系中都可以看到 mRNA 表達的下調或丟失以及 DRD2 的啟動子甲基化（圖 1E）。
以上結果表明， DRD2 是一種潛在的 TSG，也是預測 BrCa 患者預后的有希望的生物標志物。
2、DRD2 作為 TSG 起作用并抑制上皮間質轉化 (EMT)
既然發現了DRD2 是一種潛在的 TSG，那么研究人員需要進一步的研究來闡明其分子機制的細節。通過 RT-PCR (圖 2A) 和 WB (圖 2B) 構建并驗證了具有穩定過表達 DRD2 的 MDA-MB231 和 BT549 細胞。結果如下（圖2C-K）：
1. 通過CCK8測定得出，DRD2的異位表達抑制腫瘤細胞生長；單層集落形成試驗和軟瓊脂形成試驗所示，DRD2 損害了腫瘤細胞的存活能力。
2. 進一步進行細胞凋亡和細胞周期分布測定。 DRD2 表達顯著促進 BrCa 細胞凋亡并在 G2/M 期阻斷 MDA-MB231 和 BT549。此外，DRD2 的過表達促進了 BrCa 細胞對 PTX 的藥物敏感性，這表明 DRD2 還可以作為精確 PTX 治療的生物標志物。
3. 在傷口愈合試驗中，DRD2 的異位表達表現出比對照組更小的人造傷口閉合能力。
4. DRD2 的過表達顯著降低了 BrCa 遷移和侵襲。
5. 敲低表達相對較高 DRD2 的 YCCB1 中的 DRD2后能促進YCCB1增殖并抑制細胞凋亡，同時促進了YCCB1的轉移能力。
由于EMT在癌細胞的遷移和侵襲中很重要。因此研究人員進一步探究DRD2對 BrCa 細胞的 EMT的作用。WB 結果表明 E-鈣粘蛋白的表達增加，波形蛋白以及另一種前 EMT 轉錄因子 ZEB1 的表達降低。IF 染色還表明 DRD2 的異位表達誘導 MDA-MB231 失去間充質標志物波形蛋白并獲得上皮標志物 E-鈣粘蛋白。
總之，DRD2 能夠在體外和體內抑制腫瘤發生，并抑制 BrCa 細胞的 EMT。
3、DRD2 轉染的 BrCa 促進 M1 表型 Mφ
由于DRD2已被證實參與免疫調節，因此研究人員進一步探究BrCa 中的 DRD2 是否具有將 Mφ 重編程為 M1 表型的能力。
首先IHC 結果表明，在具有較高 DRD2 表達的 BrCa 組織中，M1 Mφ 的浸潤增加，M2 Mφ的濾過減少（圖 3A）。
緊接著，為了進一步研究 DRD2 在調節 TAM 中的功能，研究人員構建了 BrCa 和 Mφ 的共培養系統。結果如下（圖3B-E）：
1.如 qRT-PCR 所示，M1 表型的標記物增加，而 M2 Mφ 標記物被下調。
2. WB 結果確定 M1 標記 iNOS 被上調，而 M2 標記 CD206 被BrCa 細胞中的DRD2表達下調。
3. IF 染色顯示 Mφ 在與DRD2表達的腫瘤細胞共培養后表現出 M1 表型。
最后，為了探索將 Mφ 極化為 M1 表型的關鍵調節因子，研究人員進行了細胞因子陣列分析。盡管TNF-α 和 IFN-γ 對誘導 M1 Mφ 至關重要，但該研究表明，在與 Mφ 串擾期間，表達 DRD2 的 BrCa 細胞中 TNF-α 和 IFN-γ 沒有顯著增加。相反，這項研究表明 DRD2 顯著抑制了 BrCa 中 IL-6 和 IL-10 的表達（圖3F）。
綜上所述，DRD2 可以將 Mφ重新編程為 M1 表型，并在串擾期間顯著下調 IL-6 和 IL-10。
4、DRD2 重編程的 Mφ誘導腫瘤細胞的焦亡
進一步研究中發現來自小鼠模型的帶有 DRD2 的腫瘤表現出腫瘤細胞死亡數的增加（圖 4A），其次，根據 TUNEL 測定，DRD2 還促進體內細胞凋亡（圖 4B）。此外，Mφ在串擾期間進一步促進了 DRD2 轉染的 BrCa 細胞中 GSDME 的表達（圖 4C）。根據WB 結果得出（圖 4D），DRD2 誘導 MLKL 的磷酸化，在共培養過程中被 Mφ抑制。
此外，DRD2 表達激活了 caspase-8，并且作為共培養的結果，Mφ 抑制了激活。由于Caspase-8 被揭示是細胞凋亡、壞死性凋亡和細胞焦亡的分子開關，故研究人員進一步假設，DRD2 可能在與 Mφ的串擾期間誘導細胞焦亡。當在 BrCa 細胞中與 Mφ共培養時，DRD2 轉染的 BrCa 細胞也產生了 NLRP3 炎性體和激活的 caspase-1，這進一步產生了成熟的 IL-1β 和 IL-18，其進一步解釋了表達 DRD2 的 BrCa 細胞如何在串擾期間將 Mφ 誘導為 M1 極化。
為了確定焦亡是否由 M1 Mφ 觸發，使用 LPS 誘導的 M1 Mφ 培養基，結果表明 M1 Mφ僅觸發 NLRP3 組裝并在具有 DRD2 表達的 BrCa 細胞中切割 GSDME（圖 4E）。
上述結果表明 DRD2 可以誘導程序性細胞死亡 (PCD)，包括細胞凋亡和壞死性凋亡，在與 Mφ 的串擾期間，DRD2 進一步觸發了 NLRP3 炎癥小體和細胞焦亡的組裝。該研究還表明GSDME 而非 GSDMD 是 BrCa 細胞中 DRD2 觸發細胞焦亡的劊子手。
5、DRD2 通過中斷 TAK1 的磷酸化來限制 NF-κB 信號激活
NF-κB 信號傳導的激活對于觸發炎性體組裝和隨后的細胞焦亡至關重要。故研究人員應用實驗探索DRD2對NF-κB活化的影響。實驗結果如下（圖5A-F）：
1. IF 染色及細胞核和細胞質的提取物均表明DRD2 抑制 p-p65 的核易位，但這種抑制作用被 Mφ 抵消了。同時，DRD2似乎與LPS處理的細胞質中的p-p65結合，并且其結合通過Co-IP和IB進一步證實。
2. WB結果得知，DRD2通過LPS刺激抑制了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化。并且DRD2 抑制的 ICAM-1 被 Mφ上調，而ICAM-1為NF-κB 靶向基因，這意味著DRD2 在抑制 NF-κB 信號激活方面的關鍵作用。
3. 異位 DRD2 表達顯著抑制了 Mφ 誘導的 p65 磷酸化和 IKKα/β 的上游激活。
在細胞因子誘導的NF-κB通路激活中, 其上游激酶TAK1催化IKKα和IKKβ的激活是關鍵的步驟。研究發現異位DRD2通過抑制其上游激酶TAK1 的磷酸化表達，從而使IKKα和IKKβ去磷酸化而抑制NF-κ信號通路。
6、DRD2 激活的 β-arrestin2 損害 TAK1 和 TAB1 的結合
在與 Mφ 的串擾期間，DRD2 被觸發到內化, 作為典型的 G 蛋白偶聯受體 (GPCR)，DRD2 的內化誘導其銜接子 β-arrestin2 的質膜募集并增加其與 β-arrestin2 結合的親和力。故在LPS和CM刺激下，DRD2和β-arrestin2的蛋白質-蛋白質結合（圖5F-G）。內化的 DRD2 可以促進 TAB1 與 β-arrestin2 的結合，而激活的β-arrestin2 信號則破壞了星形膠質細胞中 TAK1-TAB1 的結合（圖5H）。最重要的是，激活的 β-arrestin2 被證實與 TAB1 競爭性結合并進一步抑制 TAK1 的磷酸化。
7、DRD2通過下調DDX5和eEF1A2抑制NF-κB通路激活和腫瘤發生
由于異位 DRD2 表達顯著抑制 p65 和 NF-κB 靶基因 IL-10 的 mRNA 表達（圖6A），這表明 DRD2 在沒有配體激活的情況下是 NF-κB 通路的負調節因子。因此研究人員推斷除了結合激活 β-arrestin2，DRD2 還可能以其他方式抑制 NF-κB 信號。
為了研究機制，研究人員通過 Co-IP 分離了可能的結合蛋白，并應用 MS 分析來鑒定蛋白質。在 MDA-MB231 和 BT549 細胞的所有結合蛋白中，DDX5、eEF1A2 和 ICAM-1 都被證實被異位 DRD2 表達下調（圖6B-C）。并且這三種蛋白質都被證明與 NF-κB 信號通路密切相關。以下結果進一步證實了異位 DRD2 表達抑制了 DDX5 和 eEF1A2 對促進 NF-κB 信號激活的顯著影響(圖6D-G)：
1. WB結果 證實了 DDX5 和 eEF1A2 的下調蛋白水平。
2. Co-IP 和 IB 測定得出DRD2、DDX5 和 eEF1A2 的結合在 293T 和 MDA-MB231，表明這三種蛋白質形成了復合物。
3. 該研究還揭示了 293T 和 MDA-MB231 中 DDX5 和 p50 之間的結合。
4. 在 BrCa 細胞中，DRD2 和 EGFR 的結合在 293T 和 MDA-MB231 中得到證實，并且DRD2表達下調ERBB1（EGFR）和ERBB2（HER2）表達，其均為NF-κB的靶基因。
5. 在異位 DRD2 表達的 BrCa 細胞中，發現 DDX5 促進 p-IκBα 的磷酸化并增加磷酸化 p65 的蛋白質水平。
6. 該研究還表明，eEF1A2 上調了 p65 磷酸化的蛋白質水平，而不影響 IKK 復合物或 IκBα，甚至在沒有 LPS 的情況下強烈上調了 p65 的磷酸化蛋白質水平。
7. 如CCK8和Transwell?測定所評估的，DDX5和eEF1A2的異位表達也削弱了DRD2對腫瘤增殖的抑制作用。
三、討論
本研究進一步揭示了DRD2在誘導M1巨噬細胞、抑制NF-κB信號通路以及觸發BrCa不同程序細胞死亡過程中的重要作用。實驗結果表明，DRD2 是觸發 PCD 必不可少的。但仍然需要更多的研究來探索DRD2如何鏈接不同的PCD并改變PCD的過程。細胞焦亡也是近期的研究熱點之一，大家也可以站在DRD2誘導細胞焦亡的分子機制這個理論基礎作進一步的研究分析哦！
