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哈嘍，大家好，小編今天給大家分享一篇文章是今年四月發表在Frontiers in Oncology雜志的，題為‘Establishment and validation of a ferroptosis-related prognostic signature for hepatocellular carcinoma’.
一背景
肝細胞癌 (HCC) 是常見原發性肝癌之一，常預后不佳。 HCC 的主要特點是其診斷時間晚、容易轉移和復發率高。 盡管有更先進的治療技術，但HCC的總體發病率和死亡率持續上升，HCC的預后仍很差。
鐵死亡于 2012 年首次提出的，典型形態學特征包括線粒體異常和壞死樣變化。 主要通過外源性和內源性途徑調節膜轉運蛋白和抗氧化酶的作用來調節細胞對鐵死亡的敏感性。 鐵死亡相關基因 (FRG) 可分為 3 類：鐵死亡抑制因子 (SOF)、鐵死亡驅動因子 (DOF) 和其他基因。大量研究表明，鐵死亡在腫瘤發生過程中具有促進和抑制腫瘤的雙重作用，這不僅取決于癌基因和腫瘤抑制因子，還取決于損傷相關分子模式 (DAMP) 的釋放。 鐵死亡損傷可引發炎癥，進一步促進腫瘤細胞侵襲和轉移，也可導致腫瘤微環境中與炎癥相關的免疫抑制，這可能有助于腫瘤生長。因此，作者進行了此項研究來說明 DOFs 誘導的鐵死亡對 HCC 預后有影響。本研究的數據集信息和工作流程如圖 1 所示。
圖1
二結果
1. 差異表達基因的鑒定
作者首先從 TCGA 數據庫中下載了 424 個樣本，其中包含 50 個正常樣本和 374 個 HCC 樣本。 經過差異分析，在腫瘤和正常樣本之間篩選了7597個差異表達基因（圖 2A）。 此外，從 FerrDb 獲得了 264 個差異表達的氧化應激基因(DOFs)。 將差異表達基因和 DOFs取交集后，作者篩選出 70 個差異表達的 DOFs（圖 2B）。
2. 預后模型的構建與驗證
作者最終納入304 個樣本，并將 HCC 樣本按 7:3 的比例隨機分為訓練集和測試集。隨后作者對訓練集中的 70 個 DOFs基因 進行了單變量 Cox 回歸分析。 結果表明，23 個 DOFs 具有統計學意義 (p<0.05)，可能具有預后價值。 隨后，作者進行了 LASSO Cox 回歸分析（圖 2C、D）。 最后，確定了由 G6PD、HRAS、NRAS、TIMM9 和 MYCN 組成的五個基因（圖 2E）。 正常組織和腫瘤組織之間的熱圖顯示了這五個基因的表達的表達（圖 2F）。
圖2
根據風險評分的中值將訓練集中的患者分為低風險組和高風險組。 Kaplan-Meier 曲線顯示，高風險組患者與較差的總生存期顯著相關（圖 3A）。 結果也在測試集和總數據集中得到驗證（圖 3B、C）。 訓練集中的 AUC 分數分別為 0.815、0.693 和 0.678，1 年、2 年和 3 年的臨界值分別為 1.714、2.012 和 2.012（圖 3D）。 對于測試集，1 年、2 年和 3 年的 AUC 分數分別達到 0.837、0.756 和 0.754，臨界值為 1.278。 （圖 3E）。 整個數據集的 AUC 評分均高于 0.69，1 年、2 年、3 年的臨界值分別為 1.714、2,050 和 1.704（圖 3F）。 訓練集和兩個驗證集中五個基因的風險評分、生存時間和生存狀態以及基因表達如圖3G-I所示。 總的來說，這些結果表明了預后模型的準確性和穩健性。
圖3
3.預后與臨床之間的關系
作者評估了風險模型在具有不同臨床特征亞組的總數據集中的預后意義。 可以看出在高風險組中年齡和分期都有意義（圖 4A-F）。 分層分析結果證實了模型在亞組中的適用性。 作者還分析了五個基因在不同腫瘤等級中的表達。 結果表明，除 MYCN 外，大多數基因在 G3 和 G4 中上調（圖 4G-K）。 這表明預后特征與腫瘤分級顯著相關。
圖4
4. 預后基因的外部驗證
作者選取了兩個外部數據集 GEO (GSE14520) 和 ICGC 數據集進行驗證。 Kaplan-Meier 曲線表明，高風險組患者的總體生存率低于低風險組患者（圖 5A、B）。 根據 ROC 分析，GEO 隊列在 1、2 和 3 年時的 AUC 分數分別為 0.641、0.629 和 0.607（圖 5C）。 對于 ICGC 隊列，1 年、2 年和 3 年的 AUC 分數分別達到 0.637、0.606 和 0.601（圖 5D）。 與TCGA數據集一致，GEO隊列和ICGC隊列各患者風險評分和生存狀態分布趨勢相同，高危組G6PD、HRAS、NRAS、MYCN和TIMM9表達增加（圖5E、F）。
圖5
5. 列線圖的構建和驗證
作者利用單變量和多變量Cox回歸分析來確定風險評分和其他臨床病理因素是否是HCC預后的獨立因素。 單變量 Cox 分析結果顯示，分期、病理 T 和風險評分與 OS 顯著相關（圖 6A）。 同時，只有風險評分在多變量 Cox 分析中顯示出相似的結果（圖 6B）。 這些結果表明，風險評分可作為 HCC 的獨立預后因素。 根據 TCGA總數據集中的單變量和多變量分析結果，建立列線圖（圖 6C）。 1 年、2 年和 3 年總生存預測的 AUC 分別為 0.819、0.710 和 0.691（圖 6D）。 以上結果驗證了列線圖預測HCC患者預后的準確性。
圖6
6.功能富集分析
GO-BP富集分析表明，這些高危組和低危組之間的DEGs主要富集在核分裂和有絲分裂核分裂中。 在 GO 細胞成分 (GO-CC) 分析中，這些 DEGs 在染色體區域、染色體和著絲粒區域中顯著富集。 對于 GO-分子功能 (GO-MF) 分析，這些 DEGs 與類固醇羥化酶活性、花生四烯酸單加氧酶活性等相關（圖 7A、B）。KEGG通路富集分析顯示，高危組在剪接體、堿基切除修復、RNA降解和卵母細胞減數分裂等方面顯著富集（圖7C）。 同時，高危組患者也參與了P53等腫瘤相關信號通路（圖7C）。 此外，低風險組也參與了多個代謝過程，包括補體和凝血級聯反應、初級膽汁酸生物合成、藥物代謝細胞色素P450、脂肪酸代謝和視黃醇代謝（圖7D）。 此外，GSEA 分析以及反應組通路表明，與高危人群相關的通路主要集中在轉錄調控和 SARS-CoV-2（包括 TP53 的轉錄調控、tRNA 加工、SARS-CoV-2 感染）（圖 7E）。 在低風險組中，富集的反應組通路也參與了代謝過程，例如支鏈氨基酸分解代謝、按底物類型排列的細胞色素 P450 和化合物的 I 相功能化（圖 7F）。
圖7
7.蛋白質-蛋白質網絡的構建
作者利用Cytoscape軟件的CytoHubba功能尋找G6PD和MYCN的hub基因。 結果表明，ENO2是G6PD和MYCN的交集（圖8A）。
8. 基因突變分析
作者從 TCGA 數據集下載突變數據后，發現高風險組和低風險組之間的 TMB 沒有顯著差異。 然而，高 TMB 和高風險組患者的預后比其他組更差（圖 8F）。 瀑布圖顯示了兩個風險亞組中的改變頻率最高的前 20 個基因（圖 8B、C）。此外，在這兩個組中，錯義突變、單核苷酸多態性 (SNP) 和 C> T突變分別為不同分類類別的主要突變類型（圖8D、E）。 作者還展示了中值變異和變異類型（圖 8D、E）。 在整個樣本中，5個預后基因的突變率都不高，只有NRAS和MYCN會發生突變（圖8G）。 錯義突變也是主要類型（圖8G）。
圖8
9. 風險評分與免疫微環境的相關性
腫瘤微環境中的免疫細胞影響腫瘤的生物學行為。結果表明中性粒細胞、巨噬細胞、DCs 和 CD8+T 細胞與高風險組相關(圖9A-D)。 然而，CD4+T 細胞和 B 細胞與風險評分沒有顯著關系（圖 9E、F）。 此外，屬于高危組的HCC患者Treg細胞、Th1細胞、巨噬細胞、衰竭細胞和CD8+T細胞等免疫細胞比例較高，而幼稚CD8+T細胞、Th17細胞和單核細胞比例較低（圖9G）。
圖9
10. 免疫治療反應和免疫檢查點
作者探討了風險評分與四種免疫檢查點基因（PDCD1、CTLA4、LAG3 和 VEGFA）之間的關聯。 結果顯示免疫檢查點的表達存在統計學顯著差異，在高風險組中更高（圖 10A-D）。同樣，這些 ICG 的表達在高風險組中更高（圖 10G）。 作者還發現，與 T 細胞組相比，G6PD、NRAS 和 HRAS 可能與腫瘤細胞/APC/DC 組中的大多數 IGC 呈中度正相關（圖 10H）。 作者使用了 TIDE 算法進一步評估患者對免疫治療的反應，可以看出TIDE 評分較低的患者可能會從免疫治療中受益（圖 10E、F）。
圖10
11.化療藥物敏感性
作者還通過比較高風險組和低風險組之間的 IC50 值來分析化學治療藥物的功效（圖 11）。 結果顯示，高危組患者絲裂霉素C、博來霉素、貝沙羅汀、吉西他濱、多柔比星和替比法尼的IC50均低于低危組患者，說明這些化療藥物可能對高危組患者有較好的療效。
圖11
12.風險模型中基因的mRNA相對表達量
作者選擇了NRAS 和 HRAS這兩個基因進行 qPCR。 結果顯示這兩個基因在 HCC 和癌旁組織之間是有差異的（圖 12A、B）。
圖12
到這里這篇文章小編就介紹完了，本文結構清晰，邏輯嚴謹，在這項研究中，在本研究中，作者首先從公共數據庫下載相應數據。 隨后，建立了一個由五個 DOFs 組成的預后模型，并在測試集和總數據集中分別對其進行了驗證。 同時, 還比較了高危組和低危組之間的免疫浸潤、免疫治療反應和化療藥物敏感性。 此外，作者通過定量實時 PCR (qRT-PCR) 分析，比較了這五個基因在腫瘤和正常組織中的表達情況。
綜上所述, 這五種鐵死亡基因顯示了 HCC 患者預后的潛力，可被視為這些患者免疫治療反應的有價值的生物標志物。
