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小伙伴們，大家早上好，今天和大家分享的文獻是近期發表在《Respiratory Research》（IF：7.16）雜志上，本文通過生信分析和基因敲除的驗證，全面分析了CENPO在泛癌中的作用，思路清晰，讓我們一起學習吧！！
Pan?cancer landscape of CENPO and its underlying mechanism in LUAD
摘要
著絲粒蛋白O (CENPO)是一種新發現的組成性著絲粒蛋白，與細胞死亡有關。然而，關于CENPO表達如何與人類癌癥或免疫浸潤相關，我們知之甚少。本文作者通過體外和體內實驗評估了CENPO在泛癌中的作用，并進一步驗證了在肺腺癌(LUAD)中的結果。
癌癥縮寫：
BLCA：膀胱移行細胞癌；BRCA：乳腺浸潤性癌；CESC：宮頸癌和子宮頸癌；CHOL：肝膽管型肝癌;COAD: 結腸腺癌;ESCA: 食管癌;GBM: 多形性膠質母細胞瘤;HNSC: 頭頸部鱗狀細胞癌;LIHC: 肝細胞癌;LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鱗癌;READ:直腸腺癌；STAD: 胃腺癌;UCEC:子宮內膜癌
1.CENPO在各種人類癌癥中的上調
首先，利用GTEx數據庫分析CENPO的表達情況，在大多數正常人體組織中，可以檢測到CENPO mRNA的表達水平(圖2A)。CENPO基因在正常人EBV轉化淋巴細胞、睪丸、脛骨神經、培養成纖維細胞、皮下脂肪組織、子宮頸，卵巢中高表達（圖2B）。利用Sangerbox數據庫研究泛癌中CENPO的表達水平，CENPO在大多數癌癥中上調，但是在甲狀腺癌(THCA)和腎嫌色細胞癌(KICH)中下調。作者使用TIMER 2.0數據庫分析了TCGA數據集中的CENPO表達。發現CENPO在大多數癌癥中上調(圖2C)，包括BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、LIHC、LUAD、LUSC、前列腺腺癌(PRAD)、READ、STAD和UCEC。但是在KICH、THCA和腎乳頭狀細胞癌(KIRP)中也呈負性調節(圖2C)。此外，與相應的正常樣本相比，在配對的腫瘤樣本中，分別有23種癌癥的CENPO表達顯著增加(圖2D)。作者又分析了CENPO與GEPIA2網站上的泛癌階段之間的關系，發現CENPO與腎上腺皮質癌(ACC)、BRCA、KICH、KIRP、LIHC、LUSC、OV和LUAD的分期顯著相關(圖2E)。這些結果表明，CENPO在各種類型的癌癥中表達上調，表明CENPO可能在癌癥診斷中發揮潛在的關鍵作用。
2.CENPO在泛癌中的診斷和預后作用
利用ROC曲線評估了CENPO對多種類型癌癥的診斷，CENPO可以作為一些癌癥很好的預后標記物（圖3A）。此外，CENPO水平的增加與ACC 、KICH、LIHC、LUAD、肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、LGG、SKCM和間皮瘤較差的生存相關（圖3B）。相比之下，在READ中，CENPO表達增加與更好的OS相關 (圖3B)。此外，DFS結果還顯示，在ACC、KICH、LIHC、LUAD、SARC、UVM、LGG、SKCM和MESO (p = 0.08)中，CENPO表達增加與預后較差相關（圖3C）。
3.CENPO參與泛癌的免疫浸潤
作者評估了泛癌中ESTIMATE評分和CENPO表達之間的關系，在一些癌癥中，CENPO表達與ESTIMATE、免疫和基質評分呈負相關（圖4A）。表明在一些腫瘤中，CENPO的高表達與免疫細胞和基質細胞浸潤減少有關，從而導致腫瘤純度高。相反，有一部分癌癥中，CENPO表達與ESTIMATE、免疫和基質評分呈正相關(圖4A)。然后作者利用Sangerbox數據庫研究了不同腫瘤中CENPO表達與腫瘤中浸潤免疫細胞水平之間的關系，CENPO表達與免疫細胞之間的關系在不同類型的腫瘤中有很大的差異，這取決于免疫細胞的類型（圖4B）。
還研究了CENPO表達水平與腫瘤突變負荷（TMB）、微衛星不穩定性（MSI）或MATH之間的關系，以確定CENPO是否是多種癌癥免疫治療反應的預測因子。在一些癌癥中，CENPO表達與TMB呈正相關（圖4C）。此外，有一部分癌癥，CENPO的表達與MSI呈正相關，而在GBML 、KIPAN和PRAD中與MSI呈負相關。(圖4D)。一部分癌癥中，CENPO的表達與MATH呈正相關，而在另一部分中與MATH呈負相關(圖4E)。
免疫檢查點(ICP)封鎖蛋白是最有希望的癌癥免疫治療靶點。因此，作者分析了在多種癌癥類型中ICP基因表達水平與CENPO的關系。在大多數腫瘤中，CENPO表達與ICP基因呈正相關。在THYM中，CENPO表達與大多數ICP基因呈負相關（圖4F）。
綜上所述，CENPO在泛癌的免疫浸潤中發揮重要作用，可能成為腫瘤治療中的一個新的免疫治療靶點。
使用TIMER 2.0研究了CENPO在免疫細胞浸潤中的潛在作用，發現大多數腫瘤中，髓源性抑制細胞(MDSC)浸潤水平與CENPO表達顯著正相關(圖5A); 排在前6位的腫瘤分別為ACC、ESCA、LIHC、LUAD、READ和UCEC (圖5B)。在大多數腫瘤中T細胞NK的浸潤水平與CENPO的表達呈負相關(圖5C); 排在前6位的腫瘤分別為BRCA-Her2、CHOL、PRAD、SARC、THCA和THYM (圖5D)。
通過TISIDB數據庫進一步分析了CENPO與趨化因子和趨化因子受體的關系，發現CENPO的表達與大多數趨化因子呈負相關(圖6A)。圖6B顯示了18種趨化因子受體與CENPO表達的相關性，并觀察到在LUAD中，CENPO與3種趨化因子受體呈負相關。CENPO表達與大多數組織相容性復合體(MHC)呈負相關，對于LUAD, CENPO表達與12種MHCs呈負相關。
4.LUAD中CENPO突變的特點
作者分析了TCGA隊列中CENPO突變狀態，在32種癌癥中觀察到CENPO改變，其中子宮癌的發病率最高（圖7A）。圖7B還顯示了CENPO突變位點、類型和數量。然后在TCGA-LUAD數據集上分析CENPO表達與體細胞突變和拷貝數變異(CNVs)等特定基因組特征之間的關系。CENPOhigh組顯示TP53、TTN、CSMD3、MUC16和ZFHX4基因的高頻率體細胞突變，CENPOlow組顯示TP53、MUC16、TTN、CSMD3和RYR2的高頻率突變(圖7C)。
5.CENPO在LUAD中的功能分析
通過LinkedOmics數據庫探討了CENPO在LUAD中的生物學功能，前50個基因與CENPO呈正相關和負相關的基因如圖所示（圖8A-C）。GO分析結果顯示CENPO主要涉及DNA依賴的DNA復制、DNA復制、細胞周期相變、細胞周期過程等(圖8D)。KEGG分析顯示在細胞周期、DNA復制、剪接體、蛋白酶體、藥物代謝等方面富集(圖8E)。CENPO與前兩個顯著富集的信號通路(包括細胞周期和DNA復制)的相關性，其中CENPO與細胞周期蛋白(包括CDK1、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CCNEA、CCNE2和CDKN2A)顯著相關(圖8F)。表明CENPO可能在LUAD的細胞周期調控中發揮關鍵作用。
6.LUAD中調節CENPO表達及相互作用基因的ceRNA網絡的構建
lncRNAs調控mRNA的表達，在腫瘤發生中發揮重要作用。作者構建了LUAD中可能調控CENPO的表達lncRNA-miRNA網絡。根據miRDB、miRWalk、Targetscan和miRabel數據庫，確定了82個可以靶向CENPO的miRNAs(圖9A)。又分析了在TCGA-LUAD中與患者生存顯著相關miRNAs，得到了43個miRNAs。在兩組的交點只有miR-370(圖9B)。表明hsa-miR-370可以靶向LUAD中CENPO的表達。通過LncBase數據庫識別到了61個可以靶向hsa-miR-370的lncRNA，其中只有10個lncRNA與LUAD患者的預后顯著相關(圖9D)。利用83個miRNA和10個lncRNA構建lncRNA-miRNA-CENPO調控網絡(圖9C)。基于HALLMARK的前5個正向富集的通路是“E2F靶標”、“G2M檢查點”、“有絲分裂紡梭體”、“mtorc1信號通路”和“MYC靶標”(圖9E)。KEGG富集結果，最顯著的正富集途徑是細胞周期，而最顯著的負富集途徑是哮喘、藥物代謝細胞色素P450、腸免疫網絡生成Ig A和視黃醇代謝(圖9F)。
利用CancerSEA的單細胞序列數據分析了CENPO和18種癌癥的功能狀態之間的關聯。CENPO與大多數癌癥的細胞周期、DNA損傷和DNA修復呈正相關(圖10A)。CENPO與大多數癌癥的缺氧和血管生成呈負相關(圖10A)。在LUAD中，CENPO表達與細胞周期(、DNA損傷、DNA修復、侵襲、增殖顯著正相關(圖10B)，與炎癥負相關(圖10B)。p = 0.0016)和分化 (圖10C)。
7.CENPO下調可誘導LUAD細胞凋亡和G2阻滯
上述的生信分析發下CENPO與細胞周期顯著相關，作者利用GEPIA2.0數據庫分析CENPO和CDK家族和Cyclin家族之間的關系，發現CENPO與CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CCNA、CCNB、CCNC和CCNE呈正相關(圖11A)。通過細胞系的培養和敲除發現，CENPO的沉默顯著誘導細胞凋亡(圖11B)和G2的阻滯(圖11C)。
綜上所述，CENPO敲除的LUAD細胞可誘導細胞凋亡，阻滯周期為G2/M期。
8.CENPO基因敲除通過mTOR信號通路抑制LUAD細胞生長和轉移
作者進一步研究了CENPO對細胞增殖和轉移的作用。IHC染色顯示，在LUAD組織中，CENPO顯著上調(圖12A)。Mann-Whitney U分析顯示，CENPO表達與腫瘤分期顯著正相關。在75個LUAD組織中，36個組織和4個正常組織中發現CENPO高表達 (圖12B)。Pearson相關分析進一步表明，CENPO高表達可預測LUAD患者病情惡化，腫瘤分期越高，CENPO高表達患者比例越高(圖12C)。
Celigo染色結果表明，CENPO基因下調可抑制A549和HCI-H1299細胞的增殖。Transwell腔室顯微照片顯示shCENPO組細胞明顯少于shCtrl組(圖13A)。與shCtrl組相比，shCENPO組A549和HCI-H1299細胞在48 h和36 h內的遷移能力分別顯著下降。每個區域侵襲細胞特異性顯示A549和HCI-H1299細胞明顯減少(圖13B-C)。
通過對小鼠異種移植模型的持續監測發現，shCENPO組小鼠腫瘤體積明顯小于shCtrl組(圖14A-B)。CENPO基因敲除后，腫瘤的平均重量明顯下降(圖14C)。當日監測結果顯示，shCENPO組的熒光強度顯著高于shCtrl組(圖14D)。隨后，免疫組化和HE染色顯示，與shCtrl組相比，shCENPO組表達KI67信號和炎癥損傷的腫瘤細胞數量明顯減少(圖14E)。此外，總結了下游信號通路的研究結果，CENPO表達的降低降低了NCI-H1299細胞中mTOR磷酸化水平，負向調節CDK1、CDK6和PIK3CA(圖14F)。因此，作者認為CENPO下調可能通過介導PIK3CA /mTOR信號通路抑制LUAD。
小結
本文主要研究泛癌中CENPO的作用，在分析的過程中，通過不同的數據庫進行分析，無論是樣本量還是后期的驗證都是具有很強的說服力的。涉及到的癌癥類型也很多，以及后續在LUAD中進一步的驗證做的方法都是很值得我們學習的。在大多數癌癥中，CENPO上調和突變，這預示了較差的預后。CENPO敲除抑制LUAD細胞的惡性表型，表現為增殖減慢、G2周期縮短、凋亡增加、遷移減少和腫瘤發生減弱。此外，CENPO敲除降低CDK1/6, PIK3CA，抑制mTOR磷酸化，提示mTOR信號通路可能參與CENPO介導的LUAD發育調控。在濕實驗小鼠體內和基因敲除都得到了很好的結果和驗證。
