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腫瘤免疫微環境包含T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、髓系細胞等多種腫瘤浸潤的免疫細胞，這些免疫細胞一方面抑制、殺傷腫瘤細胞起著抗腫瘤免疫作用，另一方面又起著促進腫瘤發展及免疫逃逸作用。因此，在當前腫瘤研究中，腫瘤免疫微環境已成為重要的關注點。然而，傳統基因測序方法只能捕獲組織樣本中不同種類細胞內基因表達信息平均后的結果，使得分析不能有效識別和刻畫腫瘤微環境中各個免疫細胞的種類及其所處狀態，同時也可能掩蓋了許多關鍵的信息。因此，近年來單細胞測序在腫瘤研究中越來越受到重視，這是由于單細胞具有更高的分辨率，有助于闡明腫瘤微環境免疫細胞對腫瘤細胞發生、發展、轉移、耐藥和免疫逃逸等分子作用機制，從而使實體瘤的臨床診治和預測變得更加準確。
生信人也一直在持續關注有關單細胞研究的文章，推出了多個單細胞相關的研究思路及角度。今天小編就再和大家分享一個值得學習的單細胞分析思路——單細胞與組織相結合：研究中如果將單細胞水平和組織水平的基因表達特征結合起來，通常能夠起到互相補充互相驗證的效果，不僅可以豐富我們的研究內容，還可以使生信結果更加可靠，使研究結論更有深度。因此，在這里小編為大家介紹一篇今年4月剛發表在Journal of Advanced Research（IF:12.822）雜志上的關于卵巢癌（ovarian cancer ;OV）免疫與預后的文章，這是一篇比較典范的單細胞與組織測序數據整合分析的文章，文章從組織入手發現現象后轉到單細胞解析后又切回組織分析，其中用到的都是比較基礎的生信方法，簡單易懂，而且用到的也都是公共數據，但最終卻發到了12+，可見組織與單細胞整合可謂雙劍合璧，常常起到一加一大于二的效果。長話短說，接下來就讓小編和大家分享下這篇文章的主要內容，一睹為快吧。
Integrated immunogenomic analysis of single-cell and bulk tissue transcriptome profiling unravels a macrophage activation paradigm associated with immunologically and clinically distinct behaviors in ovarian cancer
整合單細胞和組織轉錄組的免疫基因組分析揭示卵巢癌中與免疫和臨床差異行為相關的巨噬細胞激活模式
一． 研究背景
卵巢癌(OV)是婦科癌癥相關死亡的最常見原因，具有高發病率和死亡率。其中大多數OV患者在診斷時已處于晚期。盡管OV患者可用手術和化療等治療方案，但多數患者仍會在化療后復發，且OV復發患者的中位生存期常常低于2年，并且由于缺乏能夠準確預測化療應答的預測性生物標志物，其臨床結局仍不盡人意。而目前越來越多的證據表明，巨噬細胞亞型的激活狀態和不同譜系在腫瘤微環境中呈現動態異質性，在多種癌癥類型中發揮著關鍵作用。因此，這篇文章就重點關注了不同亞型巨噬細胞的異質性、內穩態對卵巢癌生物學和臨床結局等的影響。
二． 摘要
文章對單細胞和組織轉錄組進行了整合免疫基因組分析，系統地研究了巨噬細胞活化與預后和治療療效之間的關系。文章主要采用一致性聚類分析識別出了新的巨噬細胞亞型，并利用人工神經網絡模擬巨噬細胞的動態激活。最終在泛隊列中發現M0和M1巨噬細胞相對浸潤豐度高與預后和療效改善相關，而M2巨噬細胞則相反。研究也觀察到無監督一致性聚類分析識別出的兩個OV亞群具有不同的臨床和免疫行為。最后，作者提出了一個巨噬細胞極化衍生的人工神經網絡模型，其能夠作為一個強大的預后因子和治療療效的預測生物標志物，該模型在不同的獨立患者隊列中都得到了驗證。這篇文章刻畫了巨噬細胞的異質性并解析了其與OV預后的關系，同時強調了巨噬細胞激活模型在預防和治療腫瘤方面的臨床潛力。
三． 數據及方法
1. 數據：作者從GEO、TCGA、ArrayExpress 數據庫及PubMed發表的文獻中獲取了OV患者的腫瘤組織RNA-seq數據和臨床信息。在排除無生存數據或化療反應信息的隊列后，該研究最終納入了26個隊列的2791個OV樣本。同時研究從GEO數據庫獲得了5個獨立的OV標本的167690個細胞的單細胞RNA測序(scRNA-seq)數據和臨床信息，這五個樣本中兩個是化療耐藥患者，一個是化療難治性患者，其余兩個是化療敏感患者。此外，研究也收集了一些發表文獻的腫瘤組織RNA-seq數據和患者接受免疫阻斷治療的臨床信息。
2. 數據處理和質控：作者使用Robust Multiarray Average算法對Affymetrix HG-U133A和HGU133_Plus_2平臺的原始芯片數據進行標準化，其他平臺的處理和標準化數據由相應作者或數據庫提供。研究中scRNA-seq數據使用R包Seurat 進行質量控制和下游分析，利用其中的整合函數將5個樣本整合到一個Seurat對象中。質控過程中排除表達基因小于200個、獨特分子標識符(UMIs) 大于20,000和線粒體來源UMI計數大于10%的低質量細胞。最終有43057個細胞用作下游分析。接著作者使用Seurat中的SCTransform函數進行標準處理。并使用包DoubletFinder識別和刪除雙重事件細胞，最終留下40218個細胞后續分析。
3. 推斷腫瘤浸潤免疫細胞豐度：作者為了評估免疫微環境中特異細胞成分的分布，利用CIBERSORT測定了22種免疫細胞類型的相對比例。為了避免多個隊列之間的偏性，作者在每個隊列中分別確定了22種免疫細胞類型的相對比例，然后匯集起來進行進一步分析。
4. 一致性聚類:文章采用基于Pearson相關系數的K-means聚類方法進行一致性聚類，使用R包ConsensusClusterPlus 執行基于歐氏距離度量的聚類方法。
5. 單樣本基因集富集分析：作者從先前研究中獲取免疫調節基因，并從Molecular Signatures Database數據庫獲取hallmark基因集。每個樣本的免疫調節基因集或hallmark基因集的富集評分用 ssGSEA與GSVA進行計算。
6. 巨噬細胞極化衍生人工神經網絡模型(MacroANN)的建立：神經網絡是基于輸入層、隱藏層和輸出層的機器學習模型。它是一種廣泛應用于高維數據回歸分析和分類的方法。作者為了捕獲和量化巨噬細胞亞型的浸潤模式，使用nnet包將各亞型巨噬細胞的浸潤豐度轉化為前饋神經網絡。然后，開發了一個機器學習模型MacroANN，能夠使用一個基于神經網絡的分類器區分UnPol和M2Pol功能狀態。樣本被隨機分為訓練隊列和測試隊列。作者預測了測試隊列，并記錄了預后及化療應答的差異。該分類器也被應用于免疫治療隊列，以區分可能受益于治療的患者和可能不受益于治療的患者。
四． 主要內容及結果
1. 公開OV數據集的免疫基因組特征揭示了巨噬細胞在OV預后和化療中的關鍵作用
在文章的第一部分，作者首先定量估計了腫瘤微環境（TME）中免疫浸潤的細胞組成，并利用單因素Cox回歸分析評估了18個公開的OV隊列中每種免疫細胞類型的預后影響。然后利用18個OV隊列進行meta分析，對每種免疫細胞類型進行總體預后評估。結果發現:na?ve CD4 T細胞、靜息CD4記憶T細胞、M2巨噬細胞和嗜酸性粒細胞浸潤與預后不良相關。而活化CD4記憶T細胞、M0巨噬細胞和M1巨噬細胞浸潤與改善預后相關(圖1A)。生存分析顯示，na?ve CD4 T細胞、靜息記憶CD4 T細胞、M2巨噬細胞或嗜酸性粒細胞低浸潤患者的OS明顯高于高浸潤患者，而活化CD4記憶T細胞、M0和M1型巨噬細胞低浸潤患者的OS明顯短于高浸潤患者(圖1B)。接下來，作者在11個有化療信息的公開OV隊列中進一步研究了每種免疫細胞類型與化療應答之間的關系。結果發現化療敏感組和化療耐藥組的9種免疫細胞浸潤豐度有顯著差異(圖1C)。化療敏感組的記憶B細胞、濾泡輔助T細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化樹突狀細胞明顯富集。相比之下，化療耐藥患者na?ve B細胞、靜息NK細胞和靜息CD4記憶T細胞的浸潤豐度增加。為了進一步驗證OV中巨噬細胞的臨床意義，作者對17例OV患者(10例復發和7例不復發患者)進行了M1和M2巨噬細胞標記物CD86和CD206的免疫組化檢測。結果如圖1D所示，CD86在非復發患者組織中的表達水平顯著高于復發患者，而CD206在非復發患者組織中的表達水平顯著低于復發患者。這些結果表明，巨噬細胞與OV的預后和治療效果有關。
2. 單細胞轉錄組分析證實了巨噬細胞的功能狀態與化療反應之間的聯系
在文章的第二部分作者對5例OV患者的scRNA-seq數據進行分析。作者共分析了40218個細胞，其中31358個細胞來自化療耐藥患者，8860個單細胞來自敏感患者。作者在這些細胞中識別了四種免疫細胞類型，包括T或自然殺傷(NK)細胞、B細胞、髓樣細胞和漿細胞樣樹突狀細胞，以及四種非免疫細胞類型(圖2A)。分析發現化療耐藥樣本在成纖維細胞、髓樣細胞和上皮細胞中高度富集，而B和T或NK細胞在化療敏感樣本中富集(圖2B)。隨后髓系細胞被進一步分為5個巨噬細胞亞群，2個髓系樹突狀細胞亞群和1個單核細胞亞群(圖2C)。作者發現Macro-C1特異性表達趨化因子基因 CCL3、CCL4和CCL5，并顯示M1和M2巨噬細胞標志物共表達(圖2C和D)，而Macro-C3中FTL表達水平升高，Macro-C4高表達SPP1，Macro-C5則高表達M0巨噬細胞標志物。此外，Macro-C5表達高水平的促炎細胞因子和趨化因子(圖2D)，表示M1表型極化。這些結果表明，Macro-C2、-C3和-C4對應M2樣巨噬細胞，Macro-C5對應M1樣巨噬細胞。此外，作者也觀察到巨噬細胞亞群分布的差異，M2樣巨噬細胞在化療耐藥患者中占主導，而來自化療敏感患者的樣本則富含Macro-C5(圖2E)。隨后作者對化療耐藥和化療敏感樣本的巨噬細胞亞群進行分級聚類和KEGG通路富集分析，發現具有不同的表達模式(圖2F)。化療耐藥組的巨噬細胞亞群表達的基因涉及多種疾病相關通路(如脂質、動脈粥樣硬化和類風濕性關節炎等)。相比之下，來自化療敏感組的巨噬細胞亞群在免疫和抗腫瘤相關通路(IL-17信號通路和TNF信號通路)中富集。因此，可見scRNA-seq分析支持了組織轉錄組的發現，并表明巨噬細胞的激活狀態與化療反應性相關。
3. 巨噬細胞的功能狀態確定了臨床不同的患者亞群
在文章的第三部分，作者探討了不同亞型巨噬細胞的相對浸潤豐度與患者預后的關系。根據M0、M1和M2巨噬細胞浸潤豐度的中位值將2791個OV樣本分為8類(圖3A)。作者觀察到8組間OS有顯著差異。與其他組相比，M0hiM1hiM2lo組患者的OS更高(圖3B)。此外，作者還分析了巨噬細胞浸潤對總體應答的影響。結果顯示，M0hiM1hiM2lo組患者的化療應答率最高，而M0loM1loM2hi組患者的化療應答率最低(圖3C)。接下來，作者通過無監督一致性聚類分析，確定了兩個具有不同功能狀態的患者亞組(圖3D)，其中組1（UnPol亞型）的特征是M0和M1巨噬細胞的豐度高，而組2（M2Pol）則顯示M2巨噬細胞的豐度高和M0及M1巨噬細胞的豐度相對低。生存分析顯示，UnPol亞型與OS改善相關（圖3E)。作者還注意到，UnPol亞型與M2Pol亞型在化療應答方面顯著不同(圖3F)。此外，作者也發現TCGA定義的分子亞型幾乎可以平均分為UnPol和M2Pol亞型，這表明了這兩種亞型的實用性(圖3G)。此外，也發現這種以巨噬細胞為基礎的亞型分類通過多變量Cox回歸分析調整其他臨床特征后仍與OS保持著顯著的相關性(圖3H)。綜上所述，這些結果表明TME中的巨噬細胞極化顯著影響OV患者的臨床結局。
4. 巨噬細胞的功能狀態在免疫上區分不同的亞群
在這一部分作者進一步探索了可能導致亞組免疫行為差異的巨噬細胞的功能狀態。首先，作者從Vidotto等人的研究中獲得了包括63個免疫調節基因的基因集，其中包括免疫激活因子和抑制因子，然后計算了ssGSEA評分來評估免疫激活或抑制程度。結果發現如圖4A所示，M2Pol亞型比UnPol亞型表現出更高的免疫激活和免疫抑制，這表明兩種亞型之間可能存在不同的促進腫瘤免疫逃逸的機制。此外，作者分析了免疫檢查點分子的平均表達水平，發現M2Pol亞型比UnPol亞型表達更高(圖4B)。同時觀察到主要組織相容性復合體(MHC) I類和II類以及非經典的MHC分子(抗原呈遞分子)在M2Pol亞型中也上調(圖4B)。作者還分析了化療耐藥和敏感患者的單細胞轉錄組數據中MHC和免疫檢查點分子的表達水平，結果觀察到，與敏感患者相比，耐藥患者巨噬細胞中MHC和免疫檢查點分子的表達水平明顯更高(圖4C)。這些結果表明M2Pol亞型腫瘤表達免疫檢查點分子逃避免疫監測。作者進一步檢測UnPol和M2Pol亞組中促炎細胞因子和趨化因子的表達水平，發現促炎細胞因子優先表達于UnPol亞型，而抗炎細胞因子主要表達于M2Pol亞型(圖4D)，且腫瘤中巨噬細胞的趨化因子在不同狀態下表達不同(圖4D)，同時M2Pol亞型中腫瘤抑制因子CCL14表達上調。相比之下，促炎趨化因子CXCL5和CXCL1在UnPol亞型中表達上調。接著作者比較了UnPol亞型和M2Pol亞型在TME中不同免疫細胞亞群的分布和相對豐度，結果如圖4E所示，可以觀察到免疫抑制細胞亞群在M2Pol中富集，提示免疫抑制細胞的增加可能有助于M2Pol亞型的免疫逃逸。為了進一步研究UnPol和M2Pol亞型腫瘤是否具有不同的生物學特征，作者計算了每個樣本的hallmark基因集的ssGSEA得分，并識別了參與細胞周期、炎癥、免疫反應和細胞代謝的差異表達基因模塊(圖4F)。結果發現UnPol亞型具有細胞周期通路高激活的特點，而M2Pol亞型具有較高的炎癥或免疫反應。作者也觀察到氧化磷酸化和糖酵解標志基因集分別在M2Pol亞型和UnPol亞型中富集。
5. MacroANN預測患者的預后和治療效果
在文章的最后一部分，作者在訓練隊列中開發了巨噬細胞極化衍生的人工神經網絡模型(簡稱MacroANN)，來預測臨床結果和治療療效(圖5A)。當應用于試驗隊列時，可以觀察到MacroANN能夠區分患者化療受益(圖5B)，且受益組患者的生存時間明顯優于無受益組。接著作者為了進一步測試MacroANN是否為免疫治療應答提供了額外的預測價值，作者將MacroANN應用于三個免疫治療隊列。結果發現該模型準確預測了臨床療效，并將患者分為療效組和無效組。與無獲益組相比，預期獲益組患者的應答率更高，且在Van Allen、Hugo和Gide組中，受益組患者的緩解率均高于無獲益組患者相應的緩解率(圖5C)。此外，生存分析結果表明，預測的受益擬合組與OS改善顯著相關(圖5D)。這些結果表明，MacroANN可以預測臨床結局，以及對化療和免疫治療的應答。
到這里，這篇文章的主要內容就介紹完了。文章將單細胞與組織相結合，重點關注了卵巢癌中巨噬細胞對臨床結局，化療及免疫治療的影響。文章收集了多個平臺的數據，內容充實，方法簡潔，邏輯清晰。小編讀完感覺文章這種從組織數據入手探索免疫微環境，轉到單細胞進行驗證互補，最終回到組織指導分型及預測臨床結局的思路是文章的一大亮點。無論是主要關注組織還是重點研究單細胞的小伙伴都可以借鑒一下這個思路，畢竟單細胞與組織相輔相成，能夠幫助我們從多個維度更好的研究自己的課題。
