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各位小伙伴大家好啊！今天給大家分享的文章題為《頭頸癌的單細胞分析揭示了早期轉移過程中潛在的免疫逃逸機制》，于今年3月發表在Nature Communications（IF=17.694）雜志。
作者提到大多數的研究側重于轉移的終末事件和上皮-間充質轉化（EMT）的作用，然而頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）的bulk分析卻發現EMT不是HNSCC淋巴轉移的先決條件，所以作者重點關注跨腫瘤組織和淋巴結的細胞類型（癌細胞和CD8+ T細胞），解析相關機制，并進一步分析了潛在的治療靶點。小編認為，科學研究就應該善于發現問題，并大膽開展研究。接下來，我們一起學習一下這篇文章吧。
結果一、原發和淋巴結轉移HNSCC的單細胞轉錄狀態
為了描繪原發性腫瘤和淋巴結轉移中的“全腫瘤”單細胞景觀，作者開發了一種方案來快速處理新鮮切除的組織以進行單細胞RNA測序和建立原代培養物（圖1a）。14例局部晚期HPV陰性HNSCC患者原發瘤和頸部淋巴結組織的53459個細胞通過Seurat聚類分為上皮細胞、唾液細胞，成纖維細胞，免疫細胞和內皮細胞（圖1b、c）。統計發現原發和轉移部位之間的細胞組成存在差異（圖1d），原發腫瘤中CAFs和TAMs的比例更高，而轉移部位的B細胞、漿細胞和樹突狀細胞更多，與TCGA的bulk數據得出的細胞組成相似。此外，InferCNA發現上皮細胞中95%出現拷貝數變化，因此該亞群主要是癌細胞（圖1e）。
圖1
結果二、腫瘤細胞在轉移過程中表現出不同程度的上皮-間充質轉化
接下來，作者提取了具有拷貝數變異的上皮細胞作為腫瘤細胞進行重聚類，發現原發瘤和淋巴轉移的細胞存在重疊（圖2a）。作者為了識別來自原發瘤的具有轉移到淋巴組織的結前細胞，分析了不同樣本的細胞簇，并比較了原發瘤和淋巴轉移人群中的EMT基因，發現除HN257外，所有患者的淋巴結腫瘤細胞的EMT評分高于相應的原發瘤（圖2b）。
然后作者通過Monocle構建了軌跡以鑒定與淋巴結上皮細胞“最近鄰”的原發瘤細胞。根據起源和方向標記軌跡，結合EMT評分和CytoTRACE鑒定出三種模式（圖2c、d）：第一種，偽時序顯示從原發瘤到淋巴轉移的有序，進行性，逐步過渡，并且原發性腫瘤幾乎沒有進一步進展，偽時序過度的主要途徑包括上皮去分化、氧化磷酸化和EMT（圖2e）；第二種是淋巴結前細胞的途徑繼續明顯的軌跡，并且原發瘤也顯示出持續進化。GeneSwitch算法也鑒定出這兩種模式中進一步識別了原發瘤細胞到結前細胞分化的關鍵基因上AXL，Aurora激酶，TYMS和STAT2（圖2f）。第三種模式中腫瘤軌跡是隨意的，沒有方向性，并且沒有證據表明原發腫瘤在進化上處于“更早”的時間點（圖2g）。作者因此假設這個細胞亞群是快速發展且具有侵襲性的細胞亞群，差異表達分析發現該亞群132個上調基因參與氧化磷酸化和腫瘤代謝，而45個下調基因參與免疫逃逸（圖h），TCGA數據分析也發現相同的特征的樣本具有較差預后（圖2i）。因此，作者假設原發瘤中的不同亞群顯示出更具侵襲性的表型，可能在淋巴結播散發生后進一步進化。
圖2
結果三、識別轉移前腫瘤細胞的弱點
作者為了識別這個過程中治療干預的機會，對患者原發瘤和轉移性淋巴結中細胞衍生物進行分析。使用Seurat和PAGODA進行后續分析（圖3a），發現腫瘤細胞簇是基于患者的，并且原發瘤細胞和轉移細胞出現明顯的分離，而EMT是分化的主要途徑之一（圖2b）。作者將HN137、HN159和HN220中的結前細胞確定為與轉移細胞聚集在一起的小初級亞群。這些結前細胞的差異分析將AXL（HN137）和AURKB（HN159和HN220）確定為可能的目標（圖3c），并用免疫組織化學或免疫熒光染色驗證了腫瘤組織中兩個基因的表達（圖3d）。通過AXL和AURKB的特異性抑制劑BGB324和barasertib處理患者的原發瘤和轉移淋巴結培養物，發現經對應藥物處理的轉移性細胞與未處理細胞相比，都有較低的細胞遷移、侵襲（圖3e-g），而且與AXL低細胞相比，BGB324僅在AXL高原發瘤亞群中特異性抑制侵襲（圖3h、i）。結果bulk數據驗證ALX或AURKB與EMT之間的相關性后，作者認為AXL和AURKB在侵襲中起著重要作用，并可以作為抗轉移的靶點。
圖3
結果四、原發瘤和淋巴結轉移部位中的CD8+ T細胞的進化分析
10168個細胞降維后根據T細胞標記基因鑒定出10個T細胞亞群（圖4a、b），大多數幼稚樣細胞來源于淋巴結組織，而其余細胞群似乎在原發瘤和淋巴結轉移部位中地位相同（圖4b）。然后作者將3387個CD8+ T細胞降維聚類后，基于典型標記標記為幼稚、過渡、組織駐留記憶、功能失調前、增殖和晚期功能失調6個亞群（圖4c、d）。將CXCL13-high、LAYN 高衰竭/衰老群體作為終點后使用Slingshot確定了兩個軌跡（圖4e），軌跡1呈現幼稚標記物逐漸丟失、功能失調（和衰老）標記物逐漸增加以及中間的增殖“爆發”，可能反映了腫瘤靶向CD8+細胞克隆的擴大；而組織駐留記憶細胞(TRM)到功能失調細胞的軌跡（軌跡2）則顯示，較少的基因被激活，包括組織駐留(ITGAE)、功能失調(CTLA4)和顆粒酶(GZM)基因的表達水平被上調（圖4b）。Geneswitches算法鑒定了軌跡1中關鍵基因表達的改變和對應的TFs（圖4g），作者總結到主要節點是早期KLF2丟失、中期NKG7增加和晚期SOX4、DUSP4和RBPJ增加（圖g、h）。
圖4
結果五、調節基因驅動腫瘤靶向細胞功能障礙/耗竭
SOX4、DUSP4和RBPJ的表達似乎與功能障礙和耗竭的轉變一致，作者接下來通過兩個獨立數據集對此進行驗證。重新分析Puram的研究數據顯示功能失調的CD8細胞群中SOX4和RBPJ的表達水平更高，而DUSP4表達更普遍（圖5a）；皮膚鱗狀細胞癌患者在PD1阻斷治療前后獲得的T細胞的scRNAseq發現三個基因在耗盡的CD8亞群中均表現出更高的表達（圖5b），不過在PD1阻斷后亞群中SOX4和DUSP4的表達水平降低（圖5c）。然后作者通過RNAi敲低活化PBMC中SOX4和DUSP4的表達，發現SOX4敲低導致衰老的CD57+以及功能失調的PD1+和 CD39+群體減少（圖5d），而對HNSCC原發瘤中浸潤淋巴細胞（TIL）培養物敲低SOX4后，降低了PD1+和CD8+細胞的豐度，但對CD57+細胞沒有影響。此外，SOX4敲低還導致PD1+CD39+CD8+ TIL亞群減少（圖5e）。這不但驗證了CD8+ T細胞軌跡的功能變化，而且表明SOX4可以作為調節T細胞功能障礙/耗竭標記物表達的潛在調節劑。
圖5
結果六、使用單細胞T細胞受體測序在CD8+ T細胞中建立克隆結構
TCR分析獲得的克隆標識符可以闡明CDR3序列并提供獨特的數據集來推斷T細胞的譜系結構。作者對CD8+ T細胞中鑒定的1590個獨特的TCR序列進行分析，GLIPH算法顯示出患者之間的極小的共享，不過在17.39%的CD8+細胞中觀察到克隆擴增，克隆大小范圍為每個克隆2到60個細胞（圖5f）。此外，七名患者中的六名發現每個腫瘤（原發瘤和淋巴結）的兩個不同位點之間的克隆重疊。而且在功能失調的梯度上克隆性逐漸增加，單個幼稚或TRM衍生的克隆隨后被啟動和激活以產生跨越這些軌跡的多個功能失調的克隆（圖5g、h）
結果七、結前細胞和免疫微環境
前面分析確定了原發瘤的結前亞群具有侵襲和遷移的內在特性，但是轉移也需要獲得免疫逃逸表型，所以作者通過CellChat分析結前細胞是否特定的免疫調節表型，發現結前細胞與T淋巴細胞互作增加（圖6a），而且腫瘤細胞分泌的Midkine（MDK）與CD8+ T細胞上的MDK受體的相互作用似乎是復發性免疫抑制途徑（圖6b）。
使用MDK抑制劑處理癌細胞懸液，與對照組相比，MDK抑制劑處理后非T細胞豐度下降，而CD8+ T細胞百分比則有所增加，而且HN370和HN380中癌細胞（panCK+）和增殖性癌細胞（ki67+）的豐度也降低（圖6c），說明MDK信號可以抑制CD8介導抗腫瘤活性。接下來，作者用HN279腫瘤培養物的結前細胞構建人源化小鼠模型來研究了MDK驅動免疫抑制是否會受到抑制免疫檢查點阻斷（ICB）療法的治療，發現抗PD1治療后，腫瘤略有減小。通過單細胞RNA-seq發現大多數處理后的癌細胞表達MDK（圖6d）和許多不受ICB影響的與結前表型相關的基因（SNAI2、AXL、STAT2），不過AURKB和TOP2A（細胞周期基因）的表達顯著下調（圖6e），表明癌細胞增殖減少。
與未經治療的小鼠相比，接受pembrolizumab（治療癌癥的藥物）治療的小鼠的CD8+細胞表現出幼稚、功能失調和記憶減少，同時增殖性、細胞毒性/旁觀者、組織駐留亞群增加（圖6f、g），而表達MDK受體的CD8細胞的分析顯示出相反的趨勢，功能障礙的增加和增殖（腫瘤靶向）群體的減少（圖6h），表明MDK信號通過PD1阻斷劑消除重新激活促進免疫抑制。此外，這些變化也與NFKB1激活相關（圖6i、j）。最后，作者總結MDK信號通路是結前細胞逃避CD8介導的免疫調節的途徑。
圖6
小結：
學習完這篇文章，小編為作者清晰的條理和嚴謹的邏輯而嘆服，也發現了很多亮點：
腫瘤轉移和免疫逃逸一直是生信研究的熱點，如何推陳出新也是大家思考的重點。我想這篇文章應該可以給你一些啟發！
