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哈嘍，各位同學大家好~好久不見，分外想念呢。最近總有做實驗的同學問我，為什么你們做生信的如此高產，5分文章輕輕松松，10分文章努力一下子也不是沒有可能？ 咋說呢，可能還是因為我們多會了那么一點點生物信息學分析方法。生信文章的基礎在于數據，那些在實驗室不分晝夜、勤勤懇懇做實驗以獲取原始數據的同學是非常非常重要的。在得到原始數據后，我們要做的便是對這些數據進行處理，獲取數據中的差異部分，并尋求這些差異與疾病機制，功能上的聯系。生物信息入門很簡單，但對那些純做實驗的同學的幫助卻遠不止一點點。比如前段時間，我們相繼推出乳酸，焦亡，免疫，鐵死亡等多個專題討論，這些基因吸引了不少實驗同學的目光，卻也有很多同學不知道在自己想要研究的細胞中，癌型里該從哪個角度入手，哪組基因去做。除查閱文獻等常規操作外，生物信息完全可以幫你做好前期篩選，甚至幫你確定整個實驗流程。至于具體怎么做呢，還不趕緊和我一起開始今天的學習。下面，小編將從lncRNA，mRNA，miRNA，蛋白質組學等幾個具體實例來幫助大家更好的理解生物信息在實驗中發揮的巨大作用。
角度一：基于差異表達分析鎖定疾病進程中的關鍵LncRNA，進一步通過分子網絡構建，通路富集分析等常用生物信息學分析方法確定與LncRNA相關的調節因子以及其生物學功能，并最終通過實驗，分別從目標LncRNA的過表達和沉默兩方面對LncRNA的功能以及生物信息學預測機制進行驗證。
LncRNA CTD-2528L19.6 prevents the progression of IPF by alleviating fibroblast activation
LncRNA CTD-2528L19.6通過減輕成纖維細胞激活阻止IPF進展
（Cell Death and Disease，8.4685）
該研究首先基于差異表達分析識別IPF（特發性肺纖維化）致病性LncRNA和IPF進展型LncRNA，并構建IPF致病和進展LncRNA- mRNA的共表達網絡。通過網絡分析發現關鍵LncRNA CTD-2528L19.6，該lncRNA通過介導纖維化相關基因的表達調控成纖維細胞在IPF進展中的激活。研究者進一步基于實驗證明沉默CTD-2528L19.6可在mRNA和蛋白水平上增加Fn1和Collagen I的表達，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，加速MRC-5細胞的遷移和增殖，而CTD-2528L19.6過表達則可減輕TGF-β1誘導的MRC-5細胞成纖維細胞的激活，以及LncRNA CTD-2528L19.6可以通過調節LRRC8C的表達抑制成纖維細胞的激活。
IPF致病特征和IPF進展特征的識別（圖1）：基于生物信息學方法分別識別(1)早期IPFvs正常IPF;(2)晚期IPF vs正常;(3)晚期IPF vs早期IPF三類情況下的差異表達mRNA和LncRNA。其中，兩個LncRNA和48個mRNA在三種比較中均檢測到顯著差異表達。有趣的是與正常樣本相比，LncRNA CTD-2528L19.6、NR2F1-AS1在早期IPF患者中顯著上調，然而相較于早期IPF患者而言，在晚期IPF中又發生顯著下調，并且在晚期IPF中的表達水平仍高于正常肺組織。DCLRE1C、S100A8、THBS1等基因在正常、早期和晚期IPF中表現出表達逆轉趨勢。與正常樣本相比，在早期和晚期IPF中存在差異表達的43個差異LncRNA和835個差異mRNA被定義為IPF致病特征。與正常和早期樣本相比，在晚期IPF中發生差異表達的14個差異lncRNAs和264個差異 mRNA被定義為IPF進展特征。研究者發現所有IPF進展相關lncRNAs在正常肺向早期IPF過渡過程中均急劇上調，并有反彈趨勢。IPF進展相關lncRNAs的表達在向晚期IPF過渡過程中明顯下調，但仍高于正常肺。IPF進展相關mRNA中也觀察到類似的反彈趨勢。
圖1. IPF致病特征和IPF進展特征的識別
構建IPF致病相關共表達網絡（圖2）：為捕獲IPF發病機制的核心lncRNA-mRNA調控模塊，研究者構建IPF致病相關共表達網絡。致病共表達網絡中出現以CTD-2528L19.6為核心的子網絡。IPF致病網絡中上調的mRNA參與原發性免疫缺陷、軸突引導和T細胞受體信號通路，下調的mRNA則主要參與癌癥和癌癥相關信號通路。
圖2.構建IPF致病相關共表達網絡
構建動態IPF進展lncRNA-mRNA共表達網絡：為探索IPF進展的動態調控機制，研究者分別構建IPF早期特異性lncRNA-mRNA共表達網絡和晚期特異性lncRNA-mRNA共表達網絡。在IPF早期特定網絡中，CTD-2528L19.6與 15個mRNA存在共表達。在IPF晚期特定網絡中，CTD- 2528L19.6與6個mRNA存在共表達（圖3）。在兩個網絡中與CTD-2528L19.6相關的LRRC8C已被證實為IPF生物標志物，并有多個與CTD-2528L19.6表達相關的基因屬于纖維化相關基因 (圖4)。這些結果強調CTD-2528L19.6和LRRC8C在IPF動態進展中的調控關系。
圖3. IPF早期和晚期的共表達網絡
圖4. IPF進展中與lncRNA共表達的mRNA屬于纖維化相關基因
CTD-2528L19.6與成纖維細胞基因表達負相關：為探討CTD-2528L19.6與纖維化的關系，研究者對CTD-2528L19.6與6個IPF細胞特征基因進行相關分析，發現CTD-2528L19.6與6個IPF細胞特征基因表達負相關（圖5）。
圖5. CTD-2528L19.6與成纖維細胞基因表達負相關
沉默CTD-2528L19.6可促進MRC-5細胞成纖維細胞的活化：鎖定CTD-2528L19.6，并在細胞系水平上探究其在MRC-5細胞成纖維細胞活化中的作用（圖6）。
圖6. 沉默CTD-2528L19.6可促進MRC-5細胞成纖維細胞的活化
CTD-2528L19.6過表達可減輕TGF-β1誘導成纖維細胞的活化：沉默做完，做激活，不出意料成纖維細胞活化程度被大大減輕。
圖7. CTD-2528L19.6過表達可減輕TGF-β1誘導成纖維細胞的活化
沉默LRRC8C可減輕CTD- 2528L19.6對成纖維細胞活化的抑制作用：在共表達網絡中，CTD- 2528L19.6表達與LRRC8C在早期和晚期IPF均呈正相關，因此進一步沉默LRRC8C，探究其在CTD- 2528L19.6對成纖維細胞活化過程中的作用（圖8）。
圖8. CTD-2528L19.6在MRC-5細胞中調控LRRC8C
角度二：基于差異表達分析，預后分析，靶基因調控分析等傳統生物信息學方法識別候選miRNA，并進一步基于細胞系水平和小鼠水平實驗評估候選miRNA在抑制癌癥進展方面的治療潛力。
Systematic identification of clinically relevant miRNAs for potential miRNA-based therapy in lung adenocarcinoma
系統識別臨床相關的miRNAs用于潛在的基于miRNA的肺腺癌治療
（Mol Ther Nucleic Acids，8.8865）
該工作對TCGA的microRNA測序和RNA測序數據進行系統整合分析，以確定臨床相關的腫瘤抑制microRNA。根據差異表達、生存顯著性水平、與靶基因的相關性和對生存的累加效應，研究者最終確定三個候選miRNAs (miR-195- 5p、miR-101-3p和miR-338-5p)，并進一步基于實驗評估這些miRNAs在抑制癌癥進展方面的治療潛力。實驗結果表明，不僅單一miRNA模擬物的藥物處理有利于抑制腫瘤生長，三種miRNA模擬物的聯合使用更能有效抑制腫瘤生長和進展。
通過生物信息學方法識別候選miRNA（圖1）：基于差異表達分析和預后分析對miRNA進行過濾，最終得到五個候選miRNA（miR-195-5p、miR-30a-5p、miR-30d-5p、miR-101-3p、和miR-338-5p）。并進一步確定這些候選miRNA調控的靶基因，發現有349個具有預后意義，且在正常-疾病中發生差異表達的基因與候選miRNAs表達高度相關。基于miRTarbase中miRNA-靶基因預測關系對這些靶基因進一步過濾，最終得到47個靶基因。候選miRNAs在miRNAs-靶基因相互作用網絡中調控多個重要靶點，表明這些miRNAs在癌癥發展中發揮關鍵作用。
圖1. 通過生物信息學方法識別候選miRNAs
進一步對miRNA數量進行增加組合，并基于生存分析，探究miRNA在降低LUAD患者風險方面是否存在加成效應。結果表明，當納入更多候選miRNA時，不同miRNA組合的HR值逐漸下降，表明不同miRNA之間存在累加效應。因此，研究者選擇使HR達到最低的組合（miR-195-5p、miR-101-3p和miR-338-5p）作進一步分析，生存分析表明三個miRNA都高表達的患者比三個miRNA都低表達的患者預后更好，表明三個miRNAs共同高表達與LUAD患者預后較好有關（圖2）。
圖2. 候選miRNA的累加生存分析
體外實驗驗證3個腫瘤抑制相關候選miRNA：實驗結果表明過表達miR-195-5p、miR-101-3p或miR-338-5p可降低A549、Bm7和Hop62細胞的生長和腫瘤進展水平（圖3）。
圖3：候選miRNA單獨過表達可降低A549、Bm7和Hop62細胞的生長和腫瘤進展水平
聯合過表達候選miRNA抑制小鼠體內腫瘤生長和轉移：為證實候選miRNA的有效性，研究者進一步進行動物實驗。由于miRNA組合的有效性大于任何單個miRNA，因此研究者在小鼠實驗中進一步對三種miRNA組合進行評估。研究者將對照或三個miRNAs組合過表達的Bm7人肺癌細胞通過皮下注射到裸鼠體內，并監測產生的腫瘤的大小。結果表明，聯合過表達候選miRNA抑制小鼠體內腫瘤的生長和轉移（圖4）。
圖4. 聯合過表達候選miRNA抑制小鼠體內腫瘤生長和轉移
角度三：蛋白質組學+RNA測序基礎結合生物信息學分析確定耐藥相關蛋白質，藥物抑制和蛋白靶向實驗協同驗證免疫調節藥物耐藥機制。
Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma
蛋白質組學分析揭示CDK6上調是多發性骨髓瘤來那度胺的靶向耐藥機制
（NATURE COMMUNICATIONS，14.9196）
免疫調節藥物(IMiDs)來那度胺和波馬度胺是治療多發性骨髓瘤的有效藥物。然而，幾乎所有患者最終都因獲得性耐藥而復發，但僅在小部分病例中發現耐藥相關的基因改變。為確定耐藥的非遺傳機制，研究者對來自多發性骨髓瘤患者的5個配對治療前和復發樣本進行RNA測序以及磷酸化蛋白質組學分析。生物信息學分析揭示CDK6控制的蛋白質耐藥特征，包括骨髓瘤高危因子如TRIP13和RRM1等。進一步實驗證明在多種骨髓瘤細胞株中，CDK6的過表達降低對IMiDs的敏感性，而palbociclib抑制CDK6或蛋白水解靶向嵌合體(PROTACs)降解CDK6與IMiDs具有高度的體內外協同作用。該工作認為CDK6上調可以作為IMiDs耐藥多發性骨髓瘤的藥物靶點。
定量蛋白質組學分析識別復發性多發性骨髓瘤中失調蛋白質：生物信息學分析發現與治療前相比，復發組有130個蛋白上調，228個蛋白下調。上調程度最高的蛋白包括TRIP13、RRM1、NCAPD2、NCAPH、MORF4L1和CDK6，而下調最多的包括UPRT、DNAJC1、FCRL2、AUH、HYI和HID1。蛋白質免疫印跡分析進一步表明與原發樣本相比，CDK6，TRIP13,，RRM1蛋白在復發樣本中被更頻繁的檢測到。進一步實驗表明短期使用來那度胺或蛋白酶體抑制劑72小時，對CDK6蛋白沒有影響，甚至降低CDK6的蛋白水平，表明藥物并沒有直接誘導CDK6的表達上升從而導致耐藥（圖2）。
圖1. 復發性多發骨髓瘤患者中CDK6蛋白上調
CDK6過表達增強IMiDs耐藥：細胞系實驗表明CDK6過表達會降低IMiDs的敏感性。
圖2. CDK6過表達會降低IMiDs的敏感性
palbociclib抑制CDK6與IMiDs協同治療多發性骨髓瘤細胞：Palbociclib在多發性骨髓瘤細胞株中沒有中度活性。然而，palbociclib顯著增強IMiDs的抗多發性骨髓瘤作用。在CDK6蛋白水平升高以及CDK6過表達細胞的獲得性來那度胺耐藥細胞中，palbociclib的加入恢復與親代細胞相似的IMiDs敏感性水平，表明palbociclib治療增加多發性骨髓瘤細胞對來那度胺的敏感性（圖3）。
圖3. palbociclib與IMiD協同治療多發性骨髓瘤細胞
蛋白水解靶向嵌合體(PROTACs)降解CDK6與IMiDs具有高度的體內外協同作用（圖4）：蛋白水解靶向嵌合體(PROTACs)降解CDK6與 palbociclib抑制CDK6具有相似作用。
圖4. CDK6抑制與IKZF1/3降解協同作用
pomalidomide與palbociclib聯合治療多發性骨髓瘤的體外實驗驗證：小鼠實驗結果表明pomalidomide與palbociclib聯合治療在體外同樣有效，palbociclib抑制CDK6可以增強小鼠對pomalidomide的敏感性（圖5）。
圖5：pomalidomide與palbociclib聯合治療的體外實驗驗證
靶向骨髓瘤細胞中的CDK6可以逆轉復發蛋白特征：細胞系實驗表明在復發相關的細胞系中，復發相關蛋白的特征在CDK6被抑制后發生逆轉，進一步推測CDK6抑制通過逆轉復發相關蛋白表達特征恢復免疫治療的敏感性。
圖6：靶向骨髓瘤細胞中的CDK6可以逆轉復發蛋白特征
小結：
相信看完今天的分享小伙伴們一定對生物信息在實驗中的作用有了初步的理解和大概的掌握，最后就讓我們來總結下生物信息在實驗中的應用以及論證生物信息結論的經典實驗吧！
生物信息在實驗中的應用：
（1）確定研究對象：通過生物信息學分析鎖定在疾病進展中發揮關鍵作用的因子，進而有助于課題的確定與開展。
（2）推動實驗進程：在實驗目的確定后，進一步基于生物信息學分析識別與目標基因、蛋白質等相關的調節因子，有助于機制分析和實驗后續開展。
（3）補充完善實驗結果：在實驗完成的基礎上，同樣可以反推到組織，藥效等公開數據中進一步完善實驗結果。
論證生物信息結論的經典實驗：
（1）鎖定目標蛋白/mRNA/lncRNA后，分別通過抑制/過表達/藥物靶向抑制等多個角度驗證特征因子在疾病進展或其他藥物響應中的作用。
（2）通過檢測目標因子改變后，其他蛋白/mRNA/lncRNA等變化驗證生物信息學的預測機制。
（3）在抑制/過表達的細胞系中，對特征因子進行重塑，恢復其功能后進一步驗證特征因子功能。
好啦，今天的內容就是這些，希望咱們做生信的同學能和實驗室的小伙伴們多多交流，互通有無，成為彼此的“驕傲”和“依靠”吧！你中有我，我中有你，還怕高分文章遲遲不來嗎~
參考文獻：
1. LncRNA CTD-2528L19.6 prevents the progression of IPF by alleviating fibroblast activation
2. Systematic identification of clinically relevant miRNAs for potential miRNA-based therapy in lung adenocarcinoma
3. Proteomic profiling reveals CDK6 upregulation as a targetable resistance mechanism for lenalidomide in multiple myeloma
