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單細(xì)胞測(cè)序揭示膀胱癌癌癥干細(xì)胞維持和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
和許多惡性腫瘤一樣，膀胱癌的治療抵抗性和高復(fù)發(fā)率一直是臨床治療的重要挑戰(zhàn)，針對(duì)瘤內(nèi)異質(zhì)性的分子機(jī)制刻畫是解決的重要途徑。Huanjun Wang等人對(duì)13個(gè)膀胱癌患者組織、54971個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq，建立了多組學(xué)層面的癌癥細(xì)胞圖譜，在鑒定出不同細(xì)胞亞群的同時(shí)識(shí)別到一類癌癥干細(xì)胞群體，這種腫瘤干細(xì)胞群體富集在腫瘤復(fù)發(fā)期間，EZH2表達(dá)升高。作者進(jìn)一步定義了一種亞群特異性分子機(jī)制，通過(guò)EZH2維持H3K27me3介導(dǎo)的NCAM1基因抑制，從而使細(xì)胞侵襲性和干性轉(zhuǎn)錄程序失活。此外，作者同時(shí)也闡述了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與膀胱癌亞型的相關(guān)性。整體上這篇工作為腫瘤干細(xì)胞和EMT研究進(jìn)一步提供了豐富的資源。相關(guān)工作Single-cell analyses reveal mechanisms of cancer stem cell maintenance and epithelial-mesenchymal transition in recurrent bladder cancer于2021年9月發(fā)表在Clinical Cancer Research (IF= 12.530) 上。
結(jié)果一：人類膀胱癌組織的scRNA-seq和scATAC-seq
13位膀胱癌患者按照美國(guó)泌尿?qū)W會(huì)臨床病理標(biāo)準(zhǔn)分為三組：4位低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、5位高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和4位復(fù)發(fā)患者，進(jìn)行病理切片檢查以確定癌癥分期。取樣后進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，去除低質(zhì)量細(xì)胞之后剩余37000個(gè)細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)和17571個(gè)細(xì)胞scATAC-seq數(shù)據(jù)。針對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)使用R-Seurat的CCA方法將不同患者的數(shù)據(jù)整合分析，通過(guò)marker基因表達(dá)確定主要的細(xì)胞亞群。同樣的，在scATAC-seq數(shù)據(jù)中同樣識(shí)別細(xì)胞亞群并觀察marker基因的染色質(zhì)開放程度。無(wú)論是scRNA-seq還是scATAC-seq數(shù)據(jù)，大部分細(xì)胞都是非免疫細(xì)胞，通過(guò)scRNA-seq方式檢測(cè)到較高比例的免疫細(xì)胞，與之前的研究報(bào)道相一致。相比之下，高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者具有較高的免疫細(xì)胞。
結(jié)果二：人類膀胱癌非免疫細(xì)胞的高度異質(zhì)性
對(duì)CD45-的非免疫細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，依據(jù)亞群特異的差異表達(dá)基因結(jié)果聚為17個(gè)亞群，包括9個(gè)basal細(xì)胞亞群、4個(gè)上皮細(xì)胞亞群、4個(gè)成纖維細(xì)胞亞群。最近關(guān)于成纖維細(xì)胞分為炎性成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，作者也依據(jù)RGS5和PDGFRA marker基因表達(dá)成功分離出這兩種成纖維細(xì)胞，但是這種成纖維細(xì)胞并不是腫瘤特異的，在正常組織當(dāng)中也同樣存在。為了探索這種細(xì)胞組成是否能夠真實(shí)反映腫瘤的分子分型，通過(guò)1750個(gè)MIBC轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了高度的關(guān)聯(lián)性，并通過(guò)TCGA-BCLA數(shù)據(jù)集在bulk層面利用CIBERSORTx去卷積的方法計(jì)算細(xì)胞組成，盡管由于樣本量不同，但是整體上TCGA-BCLA數(shù)據(jù)集能夠重現(xiàn)scRNA-seq捕獲的細(xì)胞亞群。
結(jié)果三：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序揭示了復(fù)發(fā)膀胱癌中富集的異質(zhì)性的癌癥干細(xì)胞亞群
通過(guò)cancer stem cell 細(xì)胞marker CD44和ALDH1A1，在basal亞群中鑒定到兩個(gè)癌癥干細(xì)胞亞群，重新聚類則能鑒定到9個(gè)亞群，為了理解這種癌癥干細(xì)胞亞群的異質(zhì)性，作者分析了亞群特異的差異表達(dá)基因，并通過(guò)SCENIC toolkit分析了轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)，結(jié)合scATAC-seq數(shù)據(jù)最終鑒定到EZH2可能是作為癌癥干細(xì)胞導(dǎo)致復(fù)發(fā)的關(guān)鍵基因（Figure 3）。在兩個(gè)EZH2敲低的膀胱癌細(xì)胞系中，進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了EZH2對(duì)于泌尿上皮細(xì)胞癌癥干性獲得的重要性（Figure 4）。
結(jié)果四：EZH2塑造細(xì)胞粘附和干性基因的表觀圖譜
作者在野生型和EZH2敲低的細(xì)胞中進(jìn)行ATAC-seq，進(jìn)一步觀察EZH2基因表觀層面的關(guān)鍵作用。對(duì)EZH2敲低導(dǎo)致H3K27me3峰值丟失約68%，與H3K27me3的代謝活性一致。同時(shí)H3K27ac峰值增加了55%，表明的EZH2的關(guān)鍵作用影響。為了明確這種影響機(jī)制，作者進(jìn)行的相關(guān)基因的富集分析，涉及細(xì)胞粘附、EGFR信號(hào)通路、干細(xì)胞分化和組織重塑。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子也會(huì)在EZH2敲低之后呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)，例如TCF4、TCFL5和CEBPB，暗示了可能的分子作用機(jī)制。
結(jié)果五：膀胱癌中獨(dú)特的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征
對(duì)于腫瘤當(dāng)中識(shí)別到的非免疫細(xì)胞——上皮細(xì)胞，按照不同的風(fēng)險(xiǎn)分組分別進(jìn)行偽時(shí)序分析，按照偽時(shí)序發(fā)育軌跡分析差異表達(dá)基因，識(shí)別出隨著偽時(shí)序軌跡呈現(xiàn)出共表達(dá)模式的基因，包括一些EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，例如TCF3、TCF4等。這些EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子能夠直接或間接結(jié)合到E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域并抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)EMT過(guò)程。為了進(jìn)一步獲得轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，作者分析了scATA-seq數(shù)據(jù)并識(shí)別到7個(gè)亞群，TCF7可能是調(diào)控EMT過(guò)程的關(guān)鍵因子（Figure 6）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TCF7，作者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)shRNA敲低TCF7的表達(dá)，結(jié)果表明TCF7確實(shí)能夠起始EMT過(guò)程并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。
結(jié)果六：構(gòu)建亞型特異的細(xì)胞交互網(wǎng)絡(luò)
為了基因探索細(xì)胞類型之間的相互作用，作者使用CellChat方法構(gòu)建了數(shù)據(jù)集中的crosstalk 網(wǎng)絡(luò)，比較了腫瘤微環(huán)境和正常組織并進(jìn)行整合分析，為研究細(xì)胞互作提供了中規(guī)中矩的分析范式，相關(guān)結(jié)果在附圖中。
小結(jié)
作者使用scRNA-seq和scATAC-seq聯(lián)合分析的方法，分析了13個(gè)膀胱癌患者的總共50000個(gè)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EZH2通過(guò)維持腫瘤干性和TCF7促進(jìn)腫瘤EMT過(guò)程而促進(jìn)腫瘤治療抵抗和復(fù)發(fā)，為膀胱癌研究領(lǐng)域提供了非常寶貴的數(shù)據(jù)資源，同時(shí)揭示疾病本身的分子機(jī)制，為后續(xù)藥物開發(fā)、臨床治療靶點(diǎn)提供了新的視角。
