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干擾素刺激因子（STING）熱點再出高分文章

導讀

免疫抑制的腫瘤微環境是阻礙胰腺癌和其他實體癌治療的主要因素之一。干擾素基因刺激物(STING)蛋白激動劑可以觸發炎癥性先天免疫反應，會改善腫瘤的免疫抑制性，但是其機制尚不清楚。在下文中，作者在各種胰腺癌模型中應用STING激動劑。作者發現B細胞中的STING信號的缺失可以更好的控制腫瘤。此外，使用IL-35阻滯劑或基因切除B細胞中的IL-35也可以減少腫瘤的生長。B細胞中的STING-IL-35軸會減少自然殺傷(NK)細胞的增殖，并減弱NK驅動的抗腫瘤反應。

結果解讀

• STING信號活化增強B細胞

為了研究體內胰腺導管腺癌（PDAC）對注射STING激動劑的應答反應，作者在小鼠體內獲得PDAC KPC4662細胞系，并注射到WT小鼠體內建立荷瘤模型，待腫瘤成型后，靜脈注射cGAMP，并在種植腫瘤的11，17，21天收集腫瘤進行分析，發現cGAMP并不影響腫瘤生長，也不影響腫瘤和脾臟中CD45⁺細胞的數量。然而在21天的時候，腫瘤中CD19⁺B細胞在CD45⁺細胞中占比上調，且B細胞的絕對數量增加。

為了研究STING在B細胞中的作用，作者比較了兩個原位PDAC腫瘤系(KPC2173和KPC4662)在對照組小鼠(Tmem173^fl/fl)和B細胞特異性缺失STING 1(也稱為Tmem173)基因的小鼠(Cd19^cre Tmem173^fl/fl)中的生長情況。結果發現，相比于對照組Tmem173^fl/fl小鼠，Cd19^cre Tmem173^fl/fl小鼠腫瘤負荷均降低。同時，利用相同的模型，分別接種三陰乳腺癌細胞系E0771和Lewis肺癌細胞系LLC以及B16-OVA黑色素瘤細胞系，也得到了類似的結果。

為了探討cGAMP（一種STING激動劑）對B細胞的影響，作者對WT和Tem173缺陷(Tmem173^?/?)小鼠的B細胞進行了RNA測序分析。作者發現cGAMP在WT中上調了IL10和Ebi3mRNA，但在Tem173^?/?B細胞中沒有上調。Ebi3是免疫抑制細胞因子IL-27和IL-35的一個亞單位，同時也是IL-12家族的成員。在B細胞中，IL-12家族成員的其他轉錄本則不受cGAMP的影響，而IL27、IL23a和IL12b的表達幾乎檢測不到。RT-PCR分析也證實了這些結果，結果表明，anti-IgM plus cGAMP能增加WT中EBI3、IL10、IFNA和IFNB1的表達，但對Tmem173^?/?B細胞中EBI3、IL10、IFNA和IFNB1的表達沒有影響，而p35mRNA水平保持不變（圖1）。

• STING誘導B_reg細胞

為了確認cGAMP誘導IL-10和IL-35，作者進一步展開了體外實驗，發現cGAMP可以增加WT中IL-35和IL-10的頻率，但對Tmem173^?/?B細胞沒有影響。這些CD19⁺IL-35⁺細胞是CD1d^hiCD5⁺CD21^hi B細胞，這是小鼠B_reg細胞的表型特征。與單獨anti-IgM相比，cGAMP加anti-IgM會進一步增加IL-10的產生和CD19⁺CD1d^hiCD5⁺CD21^hi B_reg細胞的頻率。作者接下來測試了其他STING激動劑，如DMXAA，diABZI，ADU-S100和MSA-2，結果與cGAMP類似：能提高小鼠脾臟或腫瘤中IL-35⁺和IL10⁺Breg的頻率。但是對于cGAMP，DMXAA和diABZI并沒有減少腫瘤的生長。但增加了腫瘤和脾中CD19⁺IL-35⁺細胞的百分比，并增加了脾CD19⁺B細胞中EBI3和p35的水平。cGAMP還可提高瘤內B細胞中IL-35⁺CD19⁺和IL-10⁺CD19⁺細胞的比例（圖2）。

• STING-IRF3信號通路介導B_reg分泌細胞因子

為了進一步研究 STING介導的B_reg信號通路，作者敲除了B細胞的Tmem173或IRF3后，激動劑信號刺激并不影響IL-35⁺和IL-10⁺B細胞頻率變化；CHIP實驗顯示，激動劑刺激條件下，IRF3結合EBI3，p35和IL-10的啟動子的強度增加，說明CD19⁺B細胞中IL-35和IL-10表達上調是通過STING- IRF3信號通路。同時體內試驗顯示，注射cGAMP后，WT小鼠腫瘤和脾臟中IL-35和IL-10的水平顯著升高，腫瘤負荷更強，但是Cd19^creTmem173^fl/fl小鼠中，IL-35和IL-10不受cGAMP調控，注射前后均維持不變。

接下來，作者研究了PDAC中IL-35和IL-10的來源。隨著腫瘤的生長，這兩種細胞因子在腫瘤中都增加了，cGAMP可以增加這些細胞因子在腫瘤中的表達。在B細胞缺陷的小鼠中，腫瘤內的IL-35和IL-10幾乎消失，表明這些細胞因子來自B細胞。在cGAMP治療的CD19^creTem173 ^fl/fl PDAC荷瘤小鼠中，IL-35和IL-10保持在基線水平，表明B細胞中的STING通路是增加IL-35和IL-10所必需的。為了分析這些免疫抑制細胞因子對腫瘤的影響，作者發現KPC4662腫瘤中IL-35和IL-10的增加與腫瘤重量呈正相關，與腫瘤浸潤性CD8⁺、CD4⁺和NK1.1⁺效應細胞呈負相關(圖2)。

• IL35⁺B細胞損傷NK細胞功能

接下來，作者研究了cGAMP對EBI3、p35或IL10 B細胞特異性缺陷小鼠的治療效果，分別命名為B(EBI3^?/?)(CD19^creEbi3^fl/fl)、B(p35^?/?)和B(IL10^?/?)。將這些菌株原位注射KPC細胞，并用PBS或cGAMP處理，作者發現cGAMP能有效抑制B（BEbi3^?/?）和B（p35^-/-）小鼠腫瘤生長；相反，cGAMP促進了B（Ebi3^+/-），B（WT），B（Il10^-/-）小鼠腫瘤中IL-35⁺B細胞的浸潤。同時，敲除B細胞中的Ebi3或p35后，略微增加了腫瘤內NK細胞的水平； cGAMP處理后，NK GzmB⁺細胞頻率顯著提高。而其他類型的免疫細胞，如IL-35⁺或IL-10⁺ CD4⁺T細胞，均不受cGAMP 影響，說明B_reg特異性來源的IL-35會導致NK細胞頻率降低（圖3）。

接下來，作者評估了cGAMP聯合IL-35或IL-10中和抗體是否可以控制PDAC、LLC或B16-OVA黑色素瘤的生長。小鼠模型驗證發現，相比單體治療，聯合治療能有效提高NK1.1⁺或NK1.1⁺GzmB⁺細胞以及CD8⁺TNF⁺T細胞的腫瘤浸潤，并有效降低腫瘤負荷，提高生存率。但在消除小鼠的NK1.1⁺細胞或CD8⁺T細胞后發現，聯合治療的有效性只在缺失NK1.1⁺細胞的小鼠中出現，說明聯合治療的抗腫瘤效應是由NK細胞介導的。同時體外實驗顯示，IL-35通過降低NK細胞的TRAIL的表達繼而削弱其細胞殺傷功能。由于cGAMP和anti-IL-35的結合增加了原位PDAC中NK1.1⁺和CD8⁺亞群的數量，作者通過耗盡NK或CD8⁺T細胞來測試這些細胞類型在腫瘤抑制中的相關性。當NK1.1⁺細胞耗盡時，cGAMP加anti-IL-35治療后的腫瘤減少的現象就消失了。這說明雙重治療的抗腫瘤作用是由NK細胞介導的。為了進一步探討IL-35和NK細胞之間的這種聯系，作者在體外將NK細胞系NK-92MI與IL-35共同孵育，發現IL-35處理降低了NK細胞對K562的殺傷活性(K562是一種典型的NK靶細胞)。為了探索降低NK細胞毒性的可能機制，作者檢測了NK殺傷的關鍵介質TRAIL的表達，結果表明IL-35降低了NK細胞中TRAIL的表達水平。最后，anti-TRAIL中和抗體在雙重治療后削弱了腫瘤減少的現象（圖4）。

進一步解析cGAMP和anti-IL-35聯合治療是如何影響腫瘤內NK細胞功能。作者分離了藥物單藥/聯合治療的小鼠腫瘤模型中的NK細胞，通過單細胞測序和GSEA分析發現多條通路受到藥物治療的影響而增強，其中包括細胞增殖，細胞發育，細胞殺傷功能。聯合治療提高了NK細胞的增殖，表現為腫瘤內NK1.1⁺Ki 67⁺細胞的比例和頻率顯著提高。為了區分聯合治療和單一治療的效果，作者注意到聯合治療與對照組相比上調了358和下調了610的DEGs，cGAMP或anti-IL-35組與對照組相比沒有變化。單藥處理沒有明顯改變，但聯合處理增加的基因包括Tubb1，促進細胞增殖。作者的研究結果發現聯合治療會導致NK細胞增殖，具體的表現為腫瘤中NK1.1⁺Ki67⁺細胞總數和百分比的增加。為了研究人類胰腺腫瘤中STING和免疫抑制細胞因子之間的聯系，作者研究了TCGA的胰腺癌數據集。數據顯示，人類EBI3，IL12A，IL0的表達和Tmem173的轉錄是呈正相關。cGAMP處理能上調健康人或胰腺癌患者B細胞中EBI3，IL2A的表達。通過分析B細胞亞型，發現cGAMP處理后，選擇性的上調未成熟B細胞以及Br1細胞中EBI3和IL12 A的表達水平。最后，數據調取分析顯示，胰腺癌中，B_reg細胞表型和NK細胞活化表型呈負相關。

全文總結

綜上，整篇研究揭示了腫瘤抵抗STING激動劑單藥治療的可能機制。STING激動劑作用于腫瘤中的Breg細胞，激活STING- IRF3信號通路，上調IL-35的表達和分泌，進而抑制NK細胞的增殖，削弱NK細胞介導的抗腫瘤殺傷功能。但聯合STING激動劑和anti-IL-35抗體治療，在小鼠模型中能顯著限制抑制腫瘤生長，提高生存期，為臨床克服腫瘤免疫抑制提供了新的治療思路。

參考文獻：

1 S. Li, B. Mirlekar, B.M. Johnson, W.J. Brickey, J.A. Wrobel, N. Yang, D. Song, S. Entwistle, X. Tan, M. Deng, Y. Cui, W. Li, B.G. Vincent, M. Gale, Jr., Y. Pylayeva-Gupta, J.P. Ting, STING-induced regulatory B cells compromise NK function in cancer immunity, Nature, 610 (2022) 373-380.