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跟著nature學(xué)習(xí)如何探究腫瘤免疫逃逸形成機(jī)制
哈嘍大家好，免疫逃逸一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱門(mén)話題，也是抗癌的難題。今天給大家介紹一篇2022年12月14日發(fā)表在nature上的文章，從多個(gè)角度深入探究卵巢癌的免疫逃逸機(jī)制。
題目為“Ovarian cancer mutational processes drive site-specific immune evasion”
摘要
背景及方法：高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）是一種典型的基因組不穩(wěn)定的癌癥，具有不同的突變過(guò)程、腫瘤異質(zhì)性和腹腔內(nèi)擴(kuò)散等特點(diǎn)。免疫療法對(duì)HGSOC的療效有限，這突出了一個(gè)尚未得到滿(mǎn)足的需求，即評(píng)估突變過(guò)程和腫瘤病灶的解剖部位是如何決定腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)的。在這里，作者對(duì)42例未接受治療的HGSOC患者的160個(gè)腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行了全基因組測(cè)序、單細(xì)胞RNA測(cè)序、數(shù)字組織病理學(xué)和多路免疫熒光的綜合分析。
主要結(jié)果：同源重組缺陷型HRD Dup（BRCA1突變樣）和HRD Del（BRCA2突變樣）腫瘤含有炎癥信號(hào)和持續(xù)的免疫編輯，反映出HLA多樣性的喪失和高分化功能失調(diào)CD8+T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)。相比之下，攜帶折疊后反轉(zhuǎn)的腫瘤表現(xiàn)出較高的免疫抑制TGFβ信號(hào)和免疫排斥，主要是幼稚/干細(xì)胞樣和記憶T細(xì)胞。表型狀態(tài)關(guān)聯(lián)是特定于解剖部位的，突出了附件腫瘤和遠(yuǎn)端腹膜粘膜灶之間的組成、拓?fù)浜凸δ懿町悺?/p>
該研究結(jié)果表明，解剖部位和突變過(guò)程是HGSOC進(jìn)化表型差異和免疫抗性機(jī)制的決定因素。該研究提供了一個(gè)多組學(xué)細(xì)胞表型數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，從中開(kāi)發(fā)和解釋未來(lái)的個(gè)性化免疫治療方法和早期檢測(cè)研究。
接下來(lái)，我們?cè)敿?xì)看一下作者的整體研究吧。
背景前言
高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）的主要定義特征是拷貝數(shù)改變和基因組重排形式的深刻結(jié)構(gòu)變異，這是在幾乎普遍存在的TP53突變的遺傳背景下產(chǎn)生的。在大約一半的HGSOC病例中，同源重組（HR）修復(fù)途徑基因如BRCA1和BRCA2的體細(xì)胞和種系改變導(dǎo)致HR缺陷（HRD）。
除了基因改變，患者通過(guò)內(nèi)源性突變過(guò)程進(jìn)行分層，從全基因組測(cè)序（WGS）的結(jié)構(gòu)突變模式推斷，包括HRD亞型（BRCA1相關(guān)串聯(lián)重復(fù)，HRD-Dup；BRCA2相關(guān)間質(zhì)缺失，HRD-Del），CCNE1擴(kuò)增相關(guān)折疊倒置（FBI）的腫瘤和攜帶cdk12相關(guān)串聯(lián)重復(fù)器（TD）的腫瘤。
HGSOC提出了一個(gè)獨(dú)特的臨床挑戰(zhàn)，導(dǎo)致廣泛的腹腔內(nèi)疾病的診斷。長(zhǎng)潛伏期允許克隆多樣化和腫瘤免疫相互作用在腹膜腔的異質(zhì)性微環(huán)境中展開(kāi)。這提出了一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，即潛在的突變過(guò)程和局部組織位點(diǎn)如何影響克隆選擇、腫瘤微環(huán)境（TMEs）和免疫識(shí)別。
因此作者進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，從WGS中捕獲突變過(guò)程，從單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和在多位點(diǎn)的HGSOC病例中，基于原位多路細(xì)胞成像的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。我們的研究發(fā)現(xiàn)確定了不同的免疫刺激和免疫抑制機(jī)制，它們與疾病位點(diǎn)和突變過(guò)程共同分離，從而定義了HGSOC中免疫識(shí)別和逃逸的新決定因素。
結(jié)果
工作流程及患者信息
在24個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，從新診斷的、未接受治療的患者中收集了多個(gè)部位的組織活檢，這些患者正在接受腹腔鏡手術(shù)或初級(jí)去瘤手術(shù)。采集的解剖部位包括附件（即潛在原發(fā)病變）、網(wǎng)膜、網(wǎng)膜、腹膜、腸、腹水和其他腹腔內(nèi)部位（圖1a）。所有患者的臨床特征見(jiàn)圖1b。
患者樣本分析使用CD45+和CD45?流分類(lèi)分?jǐn)?shù)，蘇木精和伊紅（H&E）染色和多路免疫熒光（mpIF）固定組織切片，臨床腫瘤正常MSK影響和全基因組腫瘤基因測(cè)序腫瘤正常測(cè)序（圖1）。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1
位點(diǎn)特異性TME
根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建細(xì)胞類(lèi)型圖，量化了9種廣泛的細(xì)胞譜系：上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞（T和自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞）、骨髓細(xì)胞（單核/巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、肥大細(xì)胞）和基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）（圖2b、d）。
卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的患者特異性（圖2c），這歸因于腫瘤細(xì)胞特異性體細(xì)胞拷貝數(shù)的改變驅(qū)動(dòng)基因劑量效應(yīng)。患者體內(nèi)免疫細(xì)胞的組成不同（圖2e、f）。CD45?組分（從富成纖維細(xì)胞到富癌細(xì)胞樣本）在解剖部位之間大部分保守（圖2g），而CD45+組分（從富髓系細(xì)胞到富淋巴細(xì)胞樣本）有很大的差異（圖2f、g）。不出所料，腹水樣本富集T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，而附件樣本富集的T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞相對(duì)減少。在實(shí)體腫瘤部位中，在腫瘤和基質(zhì)區(qū)域的scRNA-seq、整個(gè)載玻片H&E和mpIF（圖2g-i）中的非附件部位中發(fā)現(xiàn)了較高的淋巴細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分?jǐn)?shù)。
圖2
位點(diǎn)間成分變化引出更深入的分析，以評(píng)估免疫細(xì)胞表型狀態(tài)。作者確定了10個(gè)主要的T和NK細(xì)胞集群與41個(gè)小子集群（圖3a），廣泛定義CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、先天的和γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞和循環(huán)細(xì)胞。T和NK細(xì)胞簇遵循均勻流形近似和投影（UMAP）空間的梯度（圖3b），突出了位點(diǎn)特異性的表型差異，這些差異通過(guò)擬合聚類(lèi)組成的廣義線性模型（GLM）來(lái)量化（圖3c）。
特別是，在附件樣本中，幼稚/干細(xì)胞樣和中央記憶CD4+ T細(xì)胞被耗盡，而在腹水中富集。相反，功能失調(diào)的CD4+和CD8+ T細(xì)胞在腹水中耗盡，但在附件和其他腫瘤部位富集，這與實(shí)體腫瘤中慢性抗原暴露驅(qū)動(dòng)的功能障礙一致。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞的簇也在附件樣本中富集（圖3c），這可能表明這些位點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)反饋增加。
患者實(shí)體腫瘤部位的比較顯示，非附件部位的幼稚/干樣和中央記憶T細(xì)胞富集，附件部位的功能失調(diào)的T細(xì)胞富集。附件樣本中T細(xì)胞表型的位點(diǎn)內(nèi)變異較高，表明患者體內(nèi)和患者之間實(shí)體瘤和腹水的成分差異很大（圖3d）。
分化軌跡沿著終末功能失調(diào)和干擾素刺激基因T細(xì)胞狀態(tài)的兩個(gè)軸投射CD8+T細(xì)胞（圖3e），定義為幼稚T細(xì)胞標(biāo)記物的丟失和附件和網(wǎng)膜的獲取，功能失調(diào)和細(xì)胞毒性性狀（圖3f）。值得注意的是，不同部位的表達(dá)軌跡也不同，腹水表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性模塊分?jǐn)?shù)，而附件和網(wǎng)膜中的T細(xì)胞功能失調(diào)分?jǐn)?shù)較高。
髓系和DC隔室中的表型狀態(tài)組成也隨著部位的變化而變化。因此，淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞的表型免疫狀態(tài)分化與腫瘤部位密切相關(guān)，這是TME患者內(nèi)部和患者之間變異的基礎(chǔ)，并提供了腹水免疫表型成分不代表實(shí)體瘤的明確證據(jù)。
圖3
腫瘤細(xì)胞表型多樣性
接下來(lái)，作者定義了癌細(xì)胞的突變過(guò)程如何影響癌細(xì)胞的內(nèi)在信號(hào)傳導(dǎo)和免疫表型。從CD45?細(xì)胞中鑒定出了10個(gè)上皮簇（圖4a），包括具有升高的Janus激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活物（STAT）、核因子（NF）-κB和腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)（Cancer.cell.3）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）信號(hào)（Cancer.cell.4）和缺氧（Cancer.cell.6）的細(xì)胞（圖4b）。突變特征特異性聚類(lèi)富集包括HRD-Dup中的Cancer.cell.3和FBI中的Cancer.cell.6（圖4c，d）。與FBI病例相比，在HRD-Dup病例的附件病變中，Cancer.cell.3中的所有三種免疫信號(hào)通路均顯著增加（圖4e）。相比之下，TGFβ信號(hào)在FBI病例的非附件部位更為顯著。
值得注意的是，癌細(xì)胞簇因主要組織相容性復(fù)合體（MHC）編碼基因的表達(dá)而不同（圖4f）。MHC I類(lèi)基因和MHC II類(lèi)基因在Cancer.cell.3中高度表達(dá)（圖4f）。雖然在樣本水平上，Shannon熵在突變特征中顯示出相似水平的細(xì)胞內(nèi)在多樣化，但FBI腫瘤在附件樣本對(duì)中表現(xiàn)出更高的Bray-Curtis差異（圖4g），潛在地表明這些癌細(xì)胞在遷移到遠(yuǎn)端位點(diǎn)時(shí)具有更大的表型多樣性能力。
圖4
此外，觀察到原始T細(xì)胞和功能失調(diào)T細(xì)胞的明顯組成差異是突變特征（圖5a），F(xiàn)BI腫瘤中原始/干樣和中央記憶T細(xì)胞簇和HRD腫瘤中功能失調(diào)的T細(xì)胞富集（圖5b），這同樣反映在HRD Dup腫瘤中較高的JAK-STAT信號(hào)（圖5c）和T細(xì)胞表型的分化軌跡（圖5d）。T細(xì)胞固有和癌細(xì)胞固有JAK-STAT信號(hào)在突變亞型的匹配樣本中相關(guān)（圖5e）。在HRD Dup腫瘤中發(fā)現(xiàn)了更高的表型T細(xì)胞狀態(tài)多樣性，伴隨著患者內(nèi)顯著一致的Bray-Curtis指數(shù)，這表明多樣化過(guò)程在患者之間反復(fù)發(fā)生（圖5f）。
使用mpIF，測(cè)試了HRD腫瘤中增強(qiáng)的免疫信號(hào)是否可以歸因于腫瘤中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用以及TME中的間質(zhì)隔間（圖5g）。與附件樣本相比，活化CD8+PD-1+TOX? T細(xì)胞在非附件樣本中更為普遍，HRD亞型中的差異比FBI病例中的差異更為明顯（圖5g），這意味著T細(xì)胞-抗原相互作用減少（圖5g）。
圖5
突變過(guò)程驅(qū)動(dòng)免疫編輯
接下來(lái)研究了HRD亞型中免疫信號(hào)的增加是否導(dǎo)致介導(dǎo)免疫逃逸的機(jī)制。作者使用SIGNALS算法描述了通過(guò)單細(xì)胞水平上攜帶HLA I類(lèi)和II類(lèi)基因的染色體臂6p雜合性缺失（LOH）推斷的HLA呈遞機(jī)制的缺失。預(yù)測(cè)僅限于癌細(xì)胞（圖6a），每個(gè)細(xì)胞B等位基因部分（BAF）被分類(lèi)為平衡的，不平衡或LOH和來(lái)自位點(diǎn)匹配的WGS和MSK-IMPACT數(shù)據(jù)集的正交基因組驗(yàn)證。作者觀察到明顯的患者間異質(zhì)性（圖6b，c）。值得注意的是，47個(gè)樣本中的5個(gè)樣本的附件損傷中存在克隆性6p LOH（圖6e），與主要位點(diǎn)的“早期”免疫進(jìn)化選擇一致。
HRD Dup亞型患者022和FBI亞型患者065進(jìn)一步顯示了6p LOH的患者特異性進(jìn)化時(shí)間（圖6f）。還觀察到HRD Dup中6p LOH的功能后果，包括JAK–STAT信號(hào)的上調(diào)，這在腸樣本中最為明顯，以及功能失調(diào)的CD4+和CD8+T細(xì)胞的增加（圖6g）。總之，HLA等位基因的LOH與JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)和T細(xì)胞功能障礙的關(guān)聯(lián)表明，HRD Dup腫瘤中6p丟失的“早期”免疫介導(dǎo)的進(jìn)化選擇，與FBI腫瘤中6pLOH的進(jìn)化“晚期”克隆擴(kuò)增相反。
圖6
微環(huán)境的空間拓?fù)?/strong>
上述單細(xì)胞分析將免疫表型變異與突變特征和腫瘤部位聯(lián)系起來(lái)。作者試圖通過(guò)對(duì)主要免疫細(xì)胞類(lèi)型（T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）及其功能標(biāo)志物（PD-1、TOX、PD-L1）的原位mpIF分析，通過(guò)腫瘤-免疫細(xì)胞相互作用和空間拓?fù)鋪?lái)驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。
突變特征也影響細(xì)胞相互作用，正如從scRNA-seq數(shù)據(jù)得出的髓系簇中PD-L1（CD274）和HRD亞型中T和NK細(xì)胞簇中PD-1（PDCD1）的更高受體-配體共表達(dá)所預(yù)測(cè)的。細(xì)胞鄰域的空間組織也因突變亞型而異，這反映在T細(xì)胞和panCK+PD-L1+癌細(xì)胞之間的最近鄰距離上（圖7a）。當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)和特征時(shí)，在HRD Dup附件和腸樣本中觀察到最短的中值距離，特別是在激活/功能失調(diào)和功能失調(diào)的T細(xì)胞室中（圖7b），支持PD-L1作為HRD腫瘤中激活T細(xì)胞的負(fù)反饋機(jī)制。總體而言，mpIF分析進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了位點(diǎn)和突變特征依賴(lài)性TME，與基于scRNA-seq的觀察結(jié)果一致。
圖7
小結(jié)
整體來(lái)說(shuō)，該研究結(jié)果綜合了解剖位點(diǎn)和突變過(guò)程，作為HGSOC TMEs及其表型狀態(tài)的決定因素。雖然附件部位免疫細(xì)胞的相對(duì)缺乏是由卵巢和輸卵管的免疫特權(quán)驅(qū)動(dòng)的，但這些部位功能失調(diào)的T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)反映了癌癥發(fā)展早期的免疫反應(yīng)性及轉(zhuǎn)移部位的免疫逃逸。此外，特定的轉(zhuǎn)移部位可能存在組織特異性的免疫監(jiān)測(cè)限制。TME內(nèi)和TME間的高度異質(zhì)性強(qiáng)調(diào)了免疫抵抗機(jī)制在特定患者中并不是普遍的，需要解釋單個(gè)腫瘤中免疫反應(yīng)的進(jìn)化。
總之，該研究提供了廣泛的多模態(tài)資源，繪制了HGSOC TMEs的細(xì)胞成分，并將它們與突變過(guò)程和空間環(huán)境聯(lián)系起來(lái)。結(jié)果表明即使是個(gè)性化的治療方法也可能對(duì)患者體內(nèi)廣泛的異質(zhì)性疾病無(wú)效，這突出了在擴(kuò)散到腹膜腔之前迫切需要早期發(fā)現(xiàn)。
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