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大家好！好久不見，今天為大家介紹的是一篇于2021年9月14日發表于Nature Communications，題目為《Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients》。文中對急性川崎病(Kawasaki disease，KD)患者治療前后的外周血單個核細胞進行單細胞轉錄組測序，發現單核細胞是促炎介質的主要來源，可能是PBMC的治療靶點。并且作者揭示了治療前后B/T細胞的比例變化，并對克隆擴增情況進行了具體分析，為KD的發病機制和治療提供新見解。
研究背景
川崎病(KD)是一種可導致冠狀動脈病變(CALs)的兒童期急性、全身性發熱性疾病和血管炎。這種疾病主要影響5歲以下的兒童，已成為許多發達國家兒童獲得性心臟病的最常見原因。KD的病因仍不明確，診斷仍取決于主要的臨床特征，包括發熱、皮疹、結膜炎、口腔黏膜和四肢變化以及頸部淋巴結病變。由于KD的體征和癥狀類似于其他兒童發熱性疾病，及時診斷KD仍然具有挑戰性。發熱后前10天內給予大劑量靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)是KD的標準治療，可顯著降低CAL率。但IVIG治療KD的機制尚不清楚。大約10%-20%的KD患者對IVIG耐藥，發生CAL的風險增加。最近，在嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)流行期間報道了一種新的兒童多系統炎癥綜合征(MIS-C)。盡管MIS-C和KD之間具有不同的流行病學和臨床特征，但兩種疾病均存在持續發熱和常見的皮膚粘膜表現。因此，在研究調查中迫切需要區分MIS-C和KD。
全基因組關聯研究(GWAS)已確定了一些有關KD的易感基因，包括ITPKC、CASP3、FCGR2A、CD40、MHCⅡ類在內的許多易感基因與免疫功能有關。盡管如此，50多年來，引發疾病的病原體仍存在廣泛爭議。各種病原體已被提出作為觸發因素包括超抗原毒素、EB病毒、冠狀病毒和逆轉錄病毒，但均未得到后續研究的證實。盡管病因尚不確定，但免疫系統的激活為其發病機制提供了重要證據。KD急性期血漿促炎細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-1β、干擾素(IFN)-γ水平升高。包括中性粒細胞和單核細胞在內的固有免疫細胞在外周血中升高，并在疾病早期在動脈壁中發現。外周血淋巴細胞的激活似乎也是KD發生的原因，盡管它們的作用仍存在爭議。此外，抗原特異性IgA漿細胞和CD8 + T細胞浸潤炎癥組織，意味著對通過呼吸道進入的細胞內病原體的免疫應答。
研究結果
結果（一）：研究人員收集了7例急性KD患者來源的14份新鮮外周血標本（P1-P7），對于每例患者，在IVIG治療前發熱發作后第5天采集首次血樣。第2份樣本在完成IVIG治療和退熱后24 h獲得。然后使用10×Genomics平臺對從樣本中分離的PBMC進行scRNA-seq。通過QC的檢測細胞總數為84986個，其中IVIG治療前患者的34073個細胞，治療后的36225個細胞，健康對照的14688個細胞。作者還基于scRNA-seq文庫進行了單細胞B細胞受體測序(scBCR-seq)和單細胞T細胞受體測序(scTCR-seq)。
作者使用Seurat進行細胞聚類分析，并使用SingleR進行細胞注釋，發現scRNA-seq可以很好地捕獲組成PBMC的主要細胞類型，包括T細胞(CD3D、CD3E、CD3G，60.00%)、CD4 + T細胞(CD4，36.94%)、CD8 + T細胞(CD8A、CD8B，18.53%)、自然殺傷(NK)細胞（NCAM1或CD56、KLRB1、NKG7，5.44%）、B細胞（CD19、MS4A1或CD20、CD38，22.27%）、單核細胞（CD14、CD68, FCGR3A或CD16，9.60%）、髓樣樹突狀細胞(mDC)(CD1C，0.26%)、漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)(LILRA4，0.18%)和造血干祖細胞(HSPCs)(CD34，0.12%)。與健康對照組相比，治療前KD患者顯示單核細胞和B細胞百分比增加，而T細胞和NK細胞百分比降低。
結果（二）：作者在個體水平上比較了IVIG治療前后KD患者以及健康對照者每種免疫細胞類型的百分比（圖2a）。scRNA-seq數據表明，與治療后相比，治療前KD患者的B細胞百分比增加（P = 0.02），CD4 + T細胞百分比降低（P = 0.01）（圖2a）。此外，與健康對照組相比，KD患者治療前B細胞百分比顯著增加，治療后迅速恢復正常（圖2b）。scRNA-seq數據也顯示KD患者CD8 + T細胞百分比低于健康對照組，這也與之前的報告和流式細胞術結果一致。在急性KD中有報道NK細胞減少，在單細胞數據中可以觀察到NK細胞相似的趨勢，但由于scRNA-seq的樣本量較小，缺乏統計學顯著性（圖2a）。
結果（三）：然后作者開始解析每種細胞類型的異質性。IVIG治療后，患者的CD16 + 單核細胞百分比顯著降低，未發現治療前KD患者與健康對照組之間存在顯著差異（圖3a）。在所有PBMC群體中，最多的DEG(FDR < 0.05)來自單核細胞，通過GO分析發現它們顯著富集了S100蛋白、免疫球蛋白受體、細胞因子受體、補體和受體以及MHC II類受體（FDR < 0.05，圖3b）。S100A8、S100A9和S100A12主要由中性粒細胞和單核細胞表達，它們在一系列疾病中發揮促炎功能。與治療后和健康對照相比，這些基因在治療前顯著過表達（圖3b）。同樣，大多數編碼免疫球蛋白受體的DEG在治療前KD患者中過表達，包括FCGR3A、FCGR3B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR1B和FCEG1G（圖3b）。作者發現大多數補體和受體的DEG在治療前上調，包括C1QA、C1QB、C1QC、C2、CFD、C3AR1和C5AR1（圖3b）。相反，與健康對照組相比，無論接受何種治療，KD患者中編碼MHC II類受體的大多數DEG均下調，包括HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB和HLA-DOA（圖3b）。編碼細胞因子和趨化因子受體的DEGs的表達模式更多樣。雖然其中一些在治療前患者中過表達，包括IFNAR2、IFNGR2、IL3RA、IL10RB和CX3CR1，但其他一些在治療后患者或健康對照中過表達，包括IL7R、IL13RA1、IL6ST和CXCR3（圖3b）。
由于高細胞因子血癥是KD最重要的特征之一，因此作者對細胞因子進行研究發現，IL1B和TNF主要在PBMC的單核細胞中表達，并在治療前KD患者中上調（圖3d）。除S100基因外，單核細胞也是表達CCL2、CXCL10、CXCL8、HGF、IL15、IL18、RETN和TNFRSF1B的主要來源（圖3c）。盡管并非所有這些都可以在不同條件下檢測為DEGs，但隨著單核細胞豐度的增加，預期治療前KD患者中細胞因子的總量會升高。
結果（四）：在不同的B細胞亞群中，包括幼稚B細胞(MS4A1、TCL1A，62.73%)、記憶B細胞(MS4A1、CD27、IGHA1、IGHG1，17.27%)、漿細胞(CD27、CD38、IGHA1、IGHG1，6.24%)和介于幼稚細胞和記憶細胞之間的細胞(13.77%)。IVIG治療后，總B細胞中漿細胞比例較治療前增加。
盡管B細胞在所有PBMC細胞群中的DEGs最少，但DEGs富集在幾個有趣的功能類別中，包括細胞周期過程、干擾素信號通路和S100基因（圖4c）。與治療后患者相比，治療前KD患者中許多與細胞周期正相關的DEGs上調，如CCND2、RRM2、CENPM、NME1、CKS1B和MYC，而治療前患者中抑制細胞周期的DEGs下調，如BTG2和CDKN1B（圖4c）。這些表達模式與治療前B細胞豐度顯著增加一致。治療后多個干擾素應答基因上調，包括IRF1、STAT1、ITGB7、PARP14和CD38（漿細胞表達的細胞活化標志物）（圖4c）。與健康對照組相比，KD患者中S100A8、S100A9和S100A12的表達較高，但治療前后未發現顯著性（圖4c）。
IVIG治療后，IGHA和IGHG的百分比顯著升高，表明B細胞活化導致免疫球蛋白從IgM/IgD轉換為IgG/IgA的同種型轉換。除P7外，大多數患者治療后克隆性BCR（clonal size ≥3）的百分比與治療前相比顯著增加（圖4e）。基尼系數測定的BCRs克隆性在治療后KD患者中也顯著高于治療前患者和健康對照組。值得注意的是，除P7外，在每例治療后患者中，我們均可觀察到顯著的寡克隆擴增，其主要為IgA和IgG同種型。
結果（五）：CD4 + T和CD8 + T細胞均由三個亞群組成（圖1）：幼稚細胞(CCR7，SELL，70.41%)、中央記憶細胞（CCR7，SELL和S100A4共表達，12.04%）和效應記憶細胞(S100A4，6.54%)。記憶CD8 + T細胞也表達高水平的細胞毒性相關基因(GZMK、GZMB)。此外，還發現了調節性CD4 + T細胞(FOXP3，3.51%)、γδT細胞(TRDC，5.34%)和增殖T細胞(TYMS，2.15%)。雖然沒有觀察到急性KD期間CD4 + T細胞亞群的顯著變化（補充圖16），但作者發現幼稚細胞百分比顯著增加。與健康對照組相比，KD患者CD8 + t細胞中效應記憶細胞百分比降低，表明效應記憶細胞是PBMC中CD8 + T細胞減少的主要亞群。NK細胞包括兩個亞群，CD16-高細胞(FCGR3A，89.83%)和CD56-高細胞(NCAM1，KLRC1，10.17%)。治療后CD16高NK細胞百分比降低，與CD16 + 單核細胞的趨勢相似。
CD4 + 和CD8 + T細胞中的許多DEG具有與免疫應答和能量代謝相關的相似表達模式。雖然其中一些DEGs在治療前如IFNGR2、ITITM2和SOCS3上調，但其他DEGs在治療后上調，如STAT1、IRF1、GBP1、GBP4和IL10RA。與B細胞相似，KD患者所有這些淋巴細胞群中S100基因的表達均高于健康對照組（圖5c）。此外，基因集富集分析確定了CD4 + 和CD8 + T細胞中幾個標志性基因集的顯著協調變化（圖5d），相對于治療后患者和健康對照，治療前患者中氧化磷酸化和MYC靶標被強烈激活。
根據scTCR-seq數據，發現具有克隆性TCR（clonal size≥3）的T細胞富集了高表達GZMB的效應記憶CD8 + T細胞，表明細胞具有較強的細胞溶解活性。
總結
在這項工作中，作者以單細胞分辨率對急性KD患者的外周血單個核細胞(PBMC)進行了分析。發現單核細胞是促炎介質的主要來源，可能是PBMC的治療靶點。漿細胞和效應記憶CD8 + T細胞也參與KD，其在IVIG治療后B細胞受體(BCRs)和T細胞受體(TCRs)寡克隆擴增。研究結果顯示了KD發病機制和治療中每種細胞類型特有的整體和動態免疫反應。
參考文獻：
Wang, Z., Xie, L., Ding, G. et al. Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients. Nat Commun 12, 5444 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25771-5
