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生物有自己的作息規律，例如人們日出而作日落而息，而老鼠等則晝伏夜出，這些節律的本質及運作模式還未被全面研究，在2017年關于晝夜節律分子機制的研究就獲得了諾貝爾生理醫學獎。而晝夜節律與癌癥的關聯也越來越受到關注，小編今天就給大家分享一篇2022年8月發表在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH (IF:13.007)雜志上使用公共數據研究節律紊亂與肺腺癌免疫微環境及預后關聯的單細胞分析文章。
Single‐cell transcriptomic analysis reveals circadian rhythm disruption associated with poor prognosis and drug‐resistance in lung adenocarcinoma
單細胞轉錄組分析揭示肺腺癌中晝夜節律紊亂與不良預后和耐藥有關
一．文章背景
晝夜節律是一種生物內部計時系統，也被認為是一種分子進化機制，其會通過既定的生物鐘調控能量代謝和自身維持等多種生理過程。如今越來越多的證據表明，晝夜節律的紊亂(Circadian rhythm disruption, CRD)在腫瘤發生中起著關鍵作用，并會促進癌癥的進展。因此這篇文章使用單細胞數據研究了肺腺癌中CRD與預后和耐藥的關聯。
二．文章摘要
研究開發了一個算法，并使用該算法對三個肺腺癌單細胞RNA - seq數據集中的晝夜節律紊亂狀態進行了評估。研究發現高CRD評分的惡性細胞具有糖酵解和上皮-間充質轉化通路激活的特征。此外，細胞通訊分析也表明CRD在T細胞耗竭中起重要作用，這可能是導致惡性腫瘤預后不良的原因，研究也使用組織轉錄組數據在22種癌癥中驗證了這些發現。此外，Cox回歸分析表明CRD評分是有價值的預后生物標志物。研究也建立了一個包含23個晝夜節律基因的模型，該模型在14個獨立隊列都表現出良好的免疫應答預測效能。同時，研究也觀察到細胞經褪黑素處理后CRD評分會降低。
三．文章的主要內容及結果
1. 惡性細胞的CRD與肺腺癌患者的進展相關
在文章的第一部分，作者研究了惡性細胞CRD與肺腺癌患者進展的關聯。
研究從公共數據庫獲取30個腫瘤樣本（27個為原發或遠處轉移；3個接受了新輔助化療）。研究首先確定了12個樣本的臨床已知致癌驅動基因(EGFR)突變情況，這些突變跨越了腫瘤進展的不同階段(圖1A)，經過質控后保留了96 024個細胞，并將這些細胞聚成23個細胞群，并根據標記基因將其注釋為單核細胞、NK細胞、肥大細胞、B細胞、T細胞、成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞(圖1B)。
基于評估的拷貝數變異分離出惡性細胞，且觀察到惡性細胞的數量隨著癌癥分期的進展而增加(圖1A)。惡性細胞具有樣本偏性(圖1B,C)，而非惡性細胞在患者之間沒有明顯差異(圖1B)。接下來，作者根據惡性細胞中2091個晝夜節律基因(CRGs)的表達進行加權基因共表達網絡分析(WGCNA)，識別出與樣本來源和TNM分期相關的包含358個CRGs的模塊(圖1D)，并對其進行了功能注釋(圖1E)。
接著作者基于這些基因的表達對惡性細胞的CRD評分進行了評估（圖1F）。CRD評分在遠處轉移的樣本中較高；根據CRD評分將惡性細胞分為高和低CRD組，通路富集分析顯示糖酵解、G2M檢查點和MYC靶通路在高CRD組中富集(圖1G)。相比之下，DNA修復、p53和凋亡通路在化療后的樣本中更加明顯(圖1H)。
2. CRD與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療應答相關
接下來文章研究了CRD與TKI治療應答的關聯。研究對包含22例接受TKI治療患者的21 604個細胞的數據集進行了分析，根據時間點將樣本分為3組，分別為開始靶向治療前(TN)、完全或部分緩解(RD)狀態和疾病進展(PD)狀態。研究將這些細胞注釋為免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞(圖2A)，然后使用inferCNV推斷出了4258個惡性細胞，接著比較TKI組間的細胞亞群分布，結果發現惡性細胞具有高度的TKI特異性，并且主要富集在PD樣本中(圖2B,C)。接著為了評估CRD對TKI治療的影響，研究基于358個節律基因的表達計算了惡性細胞的CRD評分(圖2B)，結果觀察到高CRD組的惡性細胞主要來自PD樣本(圖2D)。此外，轉移性和晚期患者的CRD評分也較高(圖2E)。接著研究根據CRD評分將22例患者分為高CRD組和低CRD組，結果觀察到高CRD患者的總體TKI應答率顯著低于低CRD患者(圖2F,G)。接著研究根據CRD情況和TKIs結局(應答vs.無應答)分層進行基因功能分析，其中GO分析顯示糖酵解、氧化磷酸化和自噬通路在伴高CRD的PD和TN患者中同時富集(圖2H)。此外，研究觀察到細胞因子分泌信號通路中主要在高CRD組中激活，與TKI結局無關(圖2I)。相反，在無應答者(PD)和應答者(RD)之間研究也觀察到糖酵解和細胞衰老信號的顯著差異(圖2I)，而葡萄糖和脂質代謝相關基因則在高CRD患者的惡性細胞中高表達(圖2G)，其中G6PD, HK2, ALOX5和DGKA的表達水平與CRD評分正相關(圖2J,K)。
3. CRD重塑了TME內的細胞間相互作用和細胞因子信號轉導活性
這一部分作者對CRD與腫瘤微環境中的細胞相互作用進行了分析。研究根據加權的輸入及輸出信號構建了細胞通訊網絡，觀察到惡性細胞趨化因子的總體表達水平與CRD有關(圖3A)，且高CRD組具有顯著的抑制惡性細胞產生的共刺激信號(圖3B)，此外LGALS9、FAM3C和CD47等共抑制細胞因子也在高CRD細胞中顯著升高(圖3C)。研究還發現T細胞亞群與巨噬細胞之間的互作是由CCL20介導(圖3D)，且不同CDR組的M1和M2巨噬細胞對T細胞表現出不同的共抑制和共刺激信號效應(圖3E,F)。研究也發現誘導一組協同調節的受體配體會增強CD8+ T細胞與低CRD細胞的互作(圖3G,H)。接下來研究分析了CRD是否在單細胞水平調節細胞因子信號活性，結果如圖3I所示研究識別了在高CRD惡性細胞中被激活的36個細胞因子相關通路。進一步研究也觀察到細胞因子信號在CRD高低組之間的差異激活會導致T細胞及巨噬細胞內的協同調節效應(圖3J)。
4. 使用組織轉錄組數據集驗證CRDscore的性能和魯棒性
這一部分研究使用組織數據對CRDscore的效能進行了驗證。研究首先在接受或未接受晝夜節律失調治療(CDT)的小鼠模型中收集了獨立的基因表達數據，結果在3個CDT樣本的CRD評分高于正常樣本(圖4A)。此外，治療組CRD評分表現出與信號通路特征相關(圖4B)。接著研究使用ESTIMATE評估了TCGA中LUAD樣本的免疫細胞浸潤，結果發現低CRD樣本中，免疫評分和基質評分的水平顯著高于CRD樣本。另一方面，腫瘤純度在CRD樣本中顯著富集(圖4C)。進一步研究也觀察到CRD評分和Treg和Th2細胞的浸潤豐度之間正相關(圖4D)，研究在低CRD樣本中觀察到抗原呈遞和共刺激免疫調節普遍上調(圖4E)，而缺氧、EMT和糖酵解通路則在高CRD樣本中富集(圖4F)。
5. 在LUAD等多種癌癥中CRD與不良預后相關
這一部分研究在多個癌癥中分析了CRD評分與臨床結局的關聯。研究首先在5個獨立的LUAD隊列中構建了平滑的總生存期(OS) HR曲線(圖5A-C)，并以CRD評分的截斷值作為參考線，結果觀察到CRD與OS有關。接著為了進一步評估CRD評分的預后價值，研究使用Kaplan-Meier生存分析比較了不同CRD評分組之間的OS(圖5D-F)。在LUAD隊列中，研究觀察到高CRD患者的OS明顯差于低CRD患者。進一步的亞組分析也表明所有樣本中，CRD高低組的OS存在顯著差異(圖5G)，表明CRD評分是有價值的肺腺癌預后指標。此外，研究也分析了來自TCGA的包括乳腺癌(BRCA)和前列腺癌(PRAD)在內的22種癌癥的7500多例樣本，結果發現CRD評分在大多數癌癥類型中的分布相似(圖5H)。然后，研究以評分的中位數為閾值，將所有患者分為CRD高低組(圖5I)，觀察到腫瘤樣本中的CRD評分顯著高于鄰近正常組織(圖5J)。同時，在LUAD、胰腺癌(PAAD)、間皮瘤(MESO)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)等四種癌癥類型中，高CRD患者的單因素和多因素生存模型均與更差的預后相關(圖5K)。
6. 構建一個預測ICB免疫治療應答的晝夜節律相關模型
接下來研究在兩個獨立的接受化療的LUAD隊列中檢驗了CRD評分預測免疫應答的能力。研究觀察到低CRD患者的治療效果顯著較好，其5年生存率是高CRD患者的2倍以上(圖6A,B)。此外，CRD評分可以評估NSCLC患者的TKI應答，如圖6C所示與低CRD患者相比，高CRD與顯著較差的無進展生存期有關。研究還通過預測BRCA患者對化療的反應來評估CRD得分的性能(圖6D)，結果在接受化療的BRCA隊列中，CRD評分在分類方面表現良好(圖6D)。接著研究根據突變特征將LUAD樣本分層為時鐘樣或非時鐘樣亞型，結果觀察到時鐘樣信號與LUAD患者的OS沒有顯著相關性(圖6E)，接著研究將患者分為“clock‐like mut&高CRD”和“non‐clock‐like mut&低CRD”組，結果觀察到“clock‐like mut&高CRD”組患者的生存率顯著低于另一組(圖6E)。接下來研究基于358個CRG表達譜，使用LASSO和SVM‐RFE算法識別了包含23個CRG的基因集(圖6F)，并構建了一個基于五倍交叉驗證的廣義線性回歸模型(CRGm)來預測14個獨立的癌癥隊列的治療應答。結果在所有隊列中觀察到應答(RD)樣本的CRGm預測指數均高于無應答(NR/PD)樣本(圖6G)。此外，作者將CRGm的性能與其他已發表的基于mRNA表達的免疫治療應答預測指標進行了比較 ，結果觀察到CRGm的總體性能比其他預測指標更穩健和準確(圖6H-J)。
7. 褪黑素可以減弱CRD和癌細胞的侵襲性
最后一部分研究通過體外實驗來驗證CRD與癌癥的關聯。研究首先使用RT - qPCR檢測了兩個NSCLC細胞系(A549和H1299)和一個支氣管上皮細胞系BEAS - 2B中晝夜節律核心基因的表達變化，結果觀察到CLOCK在H1299細胞中表達顯著增加(圖7A)。接著研究檢測了癌細胞的侵襲性，使用siRNA (siCLOCK)敲除CLOCK或褪黑素預處理后，觀察到細胞侵襲性受損(圖7B)。接著研究通過RNA測序評估了基因表達模式，結果識別基因的PCA展示治療組明顯聚類，且褪黑素組的差異遠大于siCLOCK組(圖7C，D)。接著研究對差異表達基因的GO分析揭示了接受抗CRD處理的細胞與晝夜節律、能量穩態和氧化應激反應等相關(圖7E)。研究也觀察到CRD評分與EMT標志物之一的SNAIL的轉錄水平呈正相關(圖7F)，此外CRD評分和SNAIL的蛋白水平可以被褪黑素顯著抑制(圖7G)，表明CRD狀態和癌細胞的侵襲能力被這種抗CRD處理減弱。
到這里這篇文章的主要內容就介紹完了，研究使用單細胞及組織數據，計算了腫瘤的節律紊亂得分，并分析了其對腫瘤免疫微環境通訊、臨床結局及免疫應答等的影響，對節律與癌癥的關聯進行了全面分析，內容豐富，邏輯清晰，有理有據，十分值得我們參考。
