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第八種可變剪切
可變剪切(Alternative Splicing，AS)是指從一個mRNA前體中通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點組合）產生不同的mRNA剪接異構體的過程。可變剪接在轉錄組的形成中起著至關重要的作用，并且該過程在癌癥中經常發生改變。
常規的可變剪接大致可分為7種基本形式：
（1）可變受體位點(AA)；（2）可變供體位點(AD)；（3）可變啟動子(AP)；（4）可變終止子(AT)；（5）內含子保留(RI)；（6）外顯子跳躍(ES)；（7）外顯子保留(ME)[1]。
最近有研究者發現一種非常規的可變剪接形式 ：Exitron splicing (EIS) [外內含子剪接]。EIS在蛋白質編碼的外顯子中創建一個隱性內含子（稱為exitron），以增加蛋白質組的多樣性。exitron是隱性內含子，在一個被注釋的外顯子內有兩個剪接位點；也就是說，exitron是一個外顯子的內部區域，同時具有蛋白質編碼（外顯子）和剪接（內含子）的潛力，有證據表明EIS在癌癥中發揮著重要作用。盡管在癌癥中可能有很大的影響，但exitron剪接在癌癥基因中的功能及其臨床相關性仍然未知。
今天解讀一下2021年三月份發表在《Molecular cell》(IF=19.328)上的一篇文章。該研究系統地檢測和描述了33種癌癥類型中的外內含子剪接事件。研究表明外內含子剪接代表了除基因改變之外的另一種癌癥驅動機制，并且外內含子剪接衍生的新抗原負擔是預測癌癥免疫療法反應的一個候選因素[2]。
文章摘要：
作者對來自9,599個腫瘤轉錄組的33種癌癥的EIS進行系統分析，發現EIS影響了63%的人類編碼基因，其中95%的事件是腫瘤特有的。研究發現EIS和其受影響基因的體細胞突變之間的相互排斥模式。在功能上，文章發現EIS改變了已知的和新的癌癥驅動基因，導致功能的獲得或喪失，從而促進腫瘤的發展。此外，EIS衍生的新表位與MHC I類或II類結合。對一個腎透明細胞癌隊列的臨床數據分析顯示，EIS衍生的新抗原負荷與檢查點抑制劑反應之間存在關聯。
主要結果：
Exitron splicing事件在癌癥中的全局圖譜
作者從TCGA數據庫中收集了33種癌癥類型的9,599名患者的RNA-Seq數據，以及670個匹配的正常樣本（圖1A）。研究者還開發了一個生物信息學工具，ScanExitron，用于分析RNA-seq數據中的外內含子檢測。ScanExitron根據剪接接頭和基因注釋來識別exitron，并通過一個剪接百分比（percent spliced out ，PSO）指標來過濾出低可信度的候選者，該指標衡量了特定exitron被剪接的轉錄本的百分比（圖1B）。
由于TCGA中的正常組織與腫瘤相鄰,而且只適用于一部分癌癥類型，作者擴大了數據來源，包括GTEx（v7）RNA-Seq數據，來自9,636個健康組織樣本，代表30個解剖部位的53種組織類型（圖1A）。在所有的腫瘤樣本中，作者觀察到卵巢癌（OV）、食道癌（ESCA）、胃癌（STAD）和急性骨髓性白血病（LAML）比其他癌癥類型具有更高的外內含子剪接負擔(圖2A）。在八種癌癥類型的薈萃分析中，作者觀察到腫瘤樣本的exitron剪接負荷明顯高于匹配的正常樣本（圖2B）。這些發現表明，exitron剪接可能有助于癌癥表型的形成。之后，作者確定了16個exitron splicing事件，這些事件在多種癌癥中顯示出反復的失調（圖2C）。受這些不同剪接的exitron影響的基因顯著地富集在由COSMIC癌癥基因上。例如，腫瘤抑制基因FOXO4和SPEN都是由于發生了exitron splicing事件而改變了基因的轉錄抑制功能（圖2D）。
腫瘤特異性exitrons能識別新的癌癥驅動基因
作者識別了主要在腫瘤樣本中剪接的exitrons，稱之為腫瘤特定exitrons（tumor-specific exitrons，TSE）。 研究者對正常樣本（TCGA正常樣本和GTEx）與TCGA腫瘤數據進行比較，以確定TSEs：1）在GTEx樣本中沒有剪接，2）在不超過三個TCGA正常樣本中剪接。 結果，共有123,338個(95.3%) exitrons被認定為TSE。 同時作者發現，與其他癌癥相比，OV、ESCA、STAD和LAML的TSE剪接事件的數量最高（圖3A）。作者實施了一種基于頻率的方法，以確定在每個腫瘤類型中富含TSE剪接事件的基因，稱為顯著外內含子剪切基因（significantly exitron-spliced genes，SEGs）。根據其剪接頻率對SEGs進行排序，發現排名前35位的SEGs顯著富集于COSMIC癌癥基因普查中的基因（圖3B）。FET蛋白家族的成員TAF15，FUS和EWSR1在排名靠前的SEG中。并且這三個基因在腫瘤樣本中的外內含子剪接是相互排斥的，意味著這些外內含子剪接事件可能有類似的功能影響（圖3C）。 此外，在FET蛋白中出現TSE改變的患者與無進展生存期受損有關（圖3D），這表明FET家族基因中的外內含子剪接可能在促進癌癥進展中發揮作用。
作者對SEGs進行了組織特異性分析。 發現NEFH是前列腺癌的一個SEG（圖3B）。因此，作者在TCGA前列腺腺癌（PRAD）隊列中檢查了NEFH的表達。NEFH在正常樣本中的表達水平明顯高于前列腺腫瘤樣本。NEFH的表達與Gleason評分成反比，Gleason評分是一個從腫瘤組織學預測癌癥侵略性的評分系統（圖3E）。作者進一步評估了NEFH在150個腫瘤和29個正常樣本中的表達，這些樣本來自MSKCC前列腺癌腫瘤基因組項目，該項目收集了基于陣列的基因表達數據和綜合臨床信息。作者發現與局部的前列腺腫瘤和正常組織相比，NEFH在轉移性前列腺癌中明顯下調（圖3F）。 此外，腫瘤中NEFH的低表達與生化復發的高風險有關（圖3G）。為了支持這一點，作者用兩個NEFH-陰性的前列腺癌細胞系C4-2和PC-3（圖3H）來驗證NEFH的功能。 當比較過量表達NEFH的前列腺癌細胞與對照組細胞時，觀察到NEFH的異位表達抑制了細胞生長（圖3I）、集落形成（圖3J）和DNA復制（圖3K），但通過裂解PARP蛋白水平測量，促進細胞凋亡（圖3H），證實了NEFH在前列腺癌中具有腫瘤抑制功能。
腫瘤特異性exitrons和體細胞突變之間的互斥性
顯著突變的基因（SMGs），如TP53、PIK3CA和KRAS，以及SEGs，如TAF15、RRBP1和NEFH被分成兩組（圖4A），這表明 SMGs和SEGs是相互排斥的。研究者把重點放在PRAD隊列上，發現NEFH是排名最高的SEG，但沒有顯示突變（圖4B）。值得注意的是，當關注PRAD隊列中顯示體細胞突變和外內含子剪接的基因時，突變和外內含子剪接之間的相互排斥模式在疾病樣本層面上是明顯的（圖4B）。在研究外內含子剪接對蛋白質功能的影響時，發現外內含子聚集在叉頭DNA結合域（FKHD）（圖4C）。將突變和外內含子映射到FKHD的三維晶體結構中，發現外內含子剪接的改變很大程度上影響了non-Wing 2區域（圖4D）。當檢查所有的TSE TCGA腫瘤時，作者發現有明顯的重疊，并且在受外內含子剪接和體細胞突變影響的蛋白家族（Pfam）領域有強烈的相關性（圖4E），表明外內含子剪接影響蛋白功能的方式與基因改變類似。
作者將基于單基因的SEG分析到基于多基因的分析，以測試TSE剪接事件是否在主要生物過程的基因組中顯著富集。利用MSigDB對特定腫瘤類型中的每個基因組進行了基于多基因的分析。確定了20個基因組在不同的腫瘤類型中因TSE剪接而發生明顯改變（圖5）。
腫瘤特異性exitrons是新表位的來源之一
為了研究TSE slicing是否有可能產生免疫原性的新抗原。作者應用ScanNeo來預測TCGA腫瘤中潛在的TSE新抗原。 對于總共123,338個獨特的TSE剪接事件，作者確定了168,206個推測的新抗原，每個TSE剪接事件平均有1.4個新抗原。在所有的腫瘤類型中，發現OV的TSE新抗原的負擔最高。作者使用MS-GF+搜索了32個OV和35個乳腺浸潤癌（BRCA）樣本的質譜（MS）數據，這些樣本來自臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟（CPTAC）項目。發現28個來自TSE拼接的新表位。 與nsSNVs和indels相比，TSE拼接在OV中每個樣本引入的CPTAC確認的新抗原數量較多，但在BRCA中數量較少（圖6A），這可能反映了兩種癌癥類型之間TSE拼接和突變引起的新抗原負擔的差異。基于MS的免疫肽組分析證實了預測的新表位MKANPALTMVSSSPTRL（圖6B）。接下來，作者計算了TSE新抗原負荷與TCGA腫瘤免疫細胞組分之間的相關性，以評估TSE新抗原負荷與免疫應答之間的相關性。發現在多種癌癥類型中，TSE新抗原負荷與較高的CD8+ T細胞、M1巨噬細胞和CD4+記憶T細胞含量呈正相關(圖6C)。作者還發現在ccRCC中TSE新抗原負荷與ICB臨床獲益之間存在顯著相關性 (圖6 D)。作者還觀察到OV和腎透明細胞癌(KIRC)是兩種最高的癌癥類型，TSE新抗原載量高的患者表達的這些免疫原性基因標記物水平較高(圖6E)。研究表明，具有高TSE新抗原負荷的卵巢腫瘤可能受益于ICB治療。
總結：
這項工作通過大規模的轉錄組分析構建了一個癌癥exitron剪接景觀。研究主要發現外內含子剪接破壞了功能性蛋白質結構域，從而導致癌癥驅動效應。通過免疫肽組分析確定了外內含子剪接衍生的新抗原。外內含子剪接的新抗原負荷預測對檢查點抑制劑治療有更好的反應。相較于傳統的七種可變剪接方式，外內含子剪接作為第八種剪接方式對于新抗原的預測和研究提供了新的思路。此外，泛癌中的外內含子剪切研究思路同樣適用于單一癌型的研究，例如最近發表的名為“Landscape of exitrons in gastric cancer”的文章[3]。這篇文章刻畫了胃癌中exitrons的特征。包括exitrons的互斥性可以協同致癌，剪切調控網絡中剪切因子靶向了異常的外內含子剪切，外內含子來源的新抗原肽在胃癌中表達。這一系列文章足以證明exitrons在癌癥中有很大的研究空間。
參考文章：
[1] Zong Z, Li H, Yi C, Ying H, Zhu Z, Wang H. Genome-Wide Profiling of Prognostic Alternative Splicing Signature in Colorectal Cancer. Front Oncol. 2018 Nov 20;8:537. doi: 10.3389/fonc.2018.00537. PMID: 30524964; PMCID: PMC6262947.
[2] Wang TY, Liu Q, Ren Y, Alam SK, Wang L, Zhu Z, Hoeppner LH, Dehm SM, Cao Q, Yang R. A pan-cancer transcriptome analysis of exitron splicing identifies novel cancer driver genes and neoepitopes. Mol Cell. 2021 May 20;81(10):2246-2260.e12. doi: 10.1016/j.molcel.2021.03.028. Epub 2021 Apr 15. PMID: 33861991; PMCID: PMC8141048.
[3] Zhang Y, Ye G, Yang Q, Zheng B, Zhang G, Hu Y, Yu J, Li G. Landscape of exitrons in gastric cancer. EBioMedicine. 2022 Sep 19;84:104272. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104272. Epub ahead of print. PMID: 36137412; PMCID: PMC9494173
