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基于驅動基因突變對肝內膽管癌聚類，得到具有明顯的分子特征和治療脆弱性的臨床相關的類群
背景介紹
膽管癌是指膽管上皮細胞惡性增殖，形成的腫瘤。主要分為3種類型：肝內膽管癌、肝門部膽管癌和肝外膽管癌。肝內膽管細胞癌（ICC）又叫膽管細胞性肝癌，它在解剖學上與肝外膽管癌(ECC)不同，是僅次于肝細胞肝癌（HCC）的第二大常見原發性肝惡性腫瘤，發生率約10～15%，男性略大于女性。具有高侵襲性和轉移性，大部分ICC患者都在癌癥晚期時才被診斷出。外科手術是ICC的首選治療方法。目前對ICC的病因尚不完全清楚，可能與肝內膽管結石，病毒性肝炎、2型糖尿病(T2DM)、肝硬化、原發性硬化性膽管炎(PSC)、先天性膽道畸形等有關。此外，寄生蟲感染（肝吸蟲?。?、有毒有害物質的暴露、代謝異常（糖尿病和肥胖）也被認為是肝內膽管細胞癌的危險因素。部分ICCs來源于大膽管的成熟膽管細胞，與ECC主要相似;而其他亞型來源于黑林管的小膽管或祖細胞，甚至具有HCC的某些特征。其病因和細胞來源的多樣性表明ICC腫瘤發生的復雜機制。因此，迫切需要建立一套有效的ICC臨床分類系統。
基因組學特征層面而言，TP53、KRAS和SMAD4突變已被確定為東方國家ICCs患者中最多的突變，主要病原包括流行肝吸蟲、病毒性肝炎和肝內膽管結石。相反，患者中 IDH1/2、BAP1、PBRM1突變和FGFR2融合情況在西方國家更為普遍。從遺傳學角度來說，驅動基因突變之間存在潛在的功能依賴網絡，具有潛在的生物學和臨床影響。迄今為止，人類癌癥的大規?；驁D譜提供了證據，證明了特定致癌基因突變之間共發和互斥的非隨機模式，這為癌癥發展提供了深刻的啟示。
數據情況
1. 突變數據
研究隊列：2013-2020年期間發表的24篇相關文獻中的805例ICC患者數據。數據類型主要有STS、WGS和WES三種。
內部驗證集：225例ICC患者，包括腫瘤分期信息。
獨立ICC隊列：包括一個212例來自MSKCC的ICCs和158例來自cbioportal數據集的ICCs隊列和一個TIGER-LC和ICGC中的239例ICCs隊列。
生存分析數據集：來自TCGA和ICGC中的178例ECCs。
2. 基因表達數據：9個CCA的基因表達數據集。
3. 甲基化數據集（450K）：GSE32079、GSE49656和GSE89803
結果
1. ICC中驅動基因突變的概覽
首先作者在圖1A中展示了本研究整體的一個流程設計。在本研究中，通過對505例WES/WGS和300例STS數據分析發現，有22個基因在至少70%的樣本中突變頻率大于2%。其中突變頻率最高的基因是TP53、KRAS、IDH1/2、ARID1A、 BAP1、PBRM1、FGFR2 融合、CDKN2A、SMAD4、PIK3CA和EPHA2(突變頻率> 5%)。所有這些基因都進行了一系列相關性的檢驗（如圖1B）。最后，在21個突變基因組合中發現了統計學上顯著的突變基因對(共同出現或互斥)，包括12個正相關和9個負相關(圖1C-D)。
2. 通過七個驅動基因的成對相關性定義三個突變群
接下來，研究人員根據7個基因(TP53、KRAS、SMAD4、IDH1/2、FGFR2融合和BAP1)的高突變頻率和強成對相關性提出一個新的聚類方式。Cluster1至少有一個KRAS/TP53/SMAD4突變;至少有一個IDH/FGFR2-fus/BAP1突變且沒有KRAS/TP53/SMAD4突變的為Cluster2；而在Cluster3中上述基因均為野生型。根據上述策略，利用研究隊列中505例樣本的WES/WGS數據對堂本進行聚類。167例(33.1%)和117例(23.2%)分別攜帶Cluster1和Cluster2突變，同時這兩類之間具有很強的互斥性。具體所有的樣本的聚類情況如圖1D所示。
3. 在其他隊列中驗證聚類方式的可靠性
為了證明上述聚類方式是穩定可靠的，研究人員又將這種方式應用到了其他樣本數據中。在研究隊列的STS數據中也發現了Cluster1突變和Cluster2突變也傾向于相互排斥，同時，Cluster1和Cluster2基因的突變頻率分別為36.9%(97/263)和27.8%(73/263)。此外，他們在另外三個隊列中也得到了類似的效果。
4. 臨床因素對Cluster1和Cluster2突變互斥性的影響
既然本文的研究對象是臨床相關的腫瘤病人，那么通過上述聚類方式得到的cluster的臨床特征又是什么樣的呢？研究發現，Cluster1和Cluster2突變在不同性別(男性/女性)、年齡(≥65 / < 65)和病因之間具有相似的互斥優勢比(ORs)。值得注意的是，腫瘤分期對Cluster1和Cluster2突變的互斥性影響最大。III/IV期患者Cluster1和Cluster2突變的OR比I/II期患者高出3倍以上。在這些樣本中，有16例具有臨床分期信息的病例是Cluster1/2共突變類型的，其中14例為III/IV期(87.5%)，這明顯高于僅具有Cluster1突變(66.2%)或Cluster2突變(55%)的病例。研究人員推測這種罕見的Cluster1/2共突變模式可能是腫瘤進化的結果。
5. 不同的突變群表現出不同的臨床病理特征
其次，研究人員比較了不同聚類的臨床病理特征。Cluster1突變在東方人群中更常見，而Cluster2突變在西方人群中更常見(圖2A)。從病因角度來說，Cluster2多見于無明確危險因素的ICCs和病毒性肝炎相關的ICCs，但在肝吸蟲感染或肝結石病例中很少發現。而Cluster1A和Cluster1B在病毒性肝炎、肝吸蟲感染和肝內結石等肝病病例中更常見(圖2B)。在圖2C中可以看到轉移性病例中Cluster1突變顯著富集。在原發性腫瘤和轉移性腫瘤之間，Cluster2突變的頻率相似，而Cluster3突變在原發性腫瘤中比轉移性腫瘤中更普遍。此外，Cluster1A ICCs的CA19-9水平最高，而Cluster2 ICCs的CA19-9水平遠低于Cluster1A和Cluster1B(圖2D)。與其他cluster相比，Cluster1A的ICCs在III/IV期患者中更富集(圖2E)。
根據組織學形態分類，ICC可分為小膽管型和大膽管型。因此研究人員還關注了內部驗證隊列中的94例ICC病例的不同突變cluster的組織學表型。值得注意的是，大多數Cluster1型ICCs，特別是Cluster1A型ICCs的組織形態主要表現為大膽管，而Cluster2型ICCs主要表現為小膽管(圖2F)。
6. 不同突變群的ICCs表現出不同的臨床特征
如圖3A所示，Cluster1突變與較差的總生存期(OS)和無復發生存期(RFS)顯著相關。相比之下，Cluster2突變的病例與Cluster3 ICCs相比，Cluster2的RFS相似，但OS相對較長。在Cluster1病例中，Cluster1A和1B ICC病例的預后同樣較差。此外，研究人員還發現Cluster1突變狀態在手術切除的ECS中沒有顯示顯著的預后價值。這表明觀察到的突變cluster的預后價值可能是ICC特異性的。
然后，研究人員還研究了不同突變cluster在接受治療的晚期ICCs中的預后價值。在來自MSKCC隊列的104例接受治療的轉移性/復發性ICCs中，與Cluster2/3的患者相比，Cluster1的患者在治療中進展率更高，OS相對更差，盡管其生存差異沒有統計學意義(圖3C)。
7. Cluster1突變與侵襲性和預后不良相關分子特征有關
分析完組織樣本數據，為了研究突變cluster之間預后差異，研究人員還分析了15個膽管癌細胞系的突變情況。利用基于238個基因富集評分的監督聚類方式，可以在5個獨立的基因表達譜數據集中將膽管癌病例分為3組 (圖3D)。結果發現Cluster1的ICCs和ECC病例大多富集在“預后不良”亞型，而Cluster2的ICCs大多集中在“預后良好”亞型。
8. 不同的突變群表現出不同的組織學和譜系相關的分子特征
利用目前已報道的膽管細胞分化基因表達標記(CD標記)，可以將CCA樣本分成不同的三種CD表型(圖4A)。大多數Cluster2的ICCs屬于CD亞型，而Cluster1的ICCs和ECCs大多聚為非CD表型或混合表型(圖4A)。利用肝干細胞樣(HpSC)基因表達特征可以在上述三個隊列中將CCAs進一步分為三種亞型 (圖4B)。大多數Cluster2型ICC病例富集于HpSC亞型，而Cluster1型ICC和ECCs多分為非HpSC或混合表型。在DNA甲基化層面研究發現Cluster2的ICCs表現出明顯高于Cluster1的ICCs的DNA甲基化水平，在Cluster2的ICCs中，FGFR2融合或BAP1突變的ICCs(沒有IDH1/2突變)與IDH突變的ICCs表現出相似的DNA甲基化模式(圖4C)。此外研究人員還發現了不同的致癌基因表達標記在不同的cluster中。例如Cluster1在ICC中顯示了一系列此前已報道的轉移或進展相關基因的最高表達水平，如TMPRSS4、S100A4、S100P、PTEGS、MUC1、COX-2、IL-6和CEACAM6。
9. IDH/FGFR2融合/BAP1和TP53/SMAD4共突變模式進一步定義了兩種預后不同的HCC亞型
根據目前的研究報道，HCC、ICC和CHC這三種最常見的原發性肝癌(PLC)亞型有時會表現出重疊表型，如膽管癌樣HCC (CLHCC)亞型。使用CCA-like特征(CC signature)可以將407個TCGA-PLC(373個HCC、36個CCA和10個CHC)隊列分為一個連續性的肝癌譜系。其中175例HCC/CHC病例顯示類似CCA的特征，并與36例CCA病例聚集在一起，表明它們本質上與CCA分子特征相似(圖5A)。與之前的研究一致，CCA、CLHCC和經典HCC的預后不同(圖5B)。譜系特異性標志物(EPCAM、CD133、KRT19、CEACAM6、HNF4A和ALB)在這三種亞型中也是差異表達的(圖5C)。與分化良好的HCC的組織學形態相比，這些CLHCCs的顯微鏡下特征表現為“CCA-like型”(圖5D)。同時，研究人員還發現TP53/SMAD4突變和IDH/FGFR2-fus/BAP1突變的百分比顯著升高，而CTNNB1在CLHCC亞型中的突變率低于經典HCC亞型(圖5A)。與ICC一致，這兩類cluster也傾向于相互排斥(圖5E)，與Cluster2 CLHCCs相比，Cluster1B CLHCCs的OS和RFS也明顯更短(圖5F)。
10. 具有不同聚類突變的ICC細胞對分子靶向治療表現出不同的敏感性
考慮到Cluster1和Cluster2 ICCs之間的分子差異，研究人員認為比較它們對分子靶向治療的響應可能也是不一樣的。一共篩選了六種ICC細胞系(包括兩種Cluster1A:兩種Cluster1B和兩種Cluster2A突變細胞系)進行研究。細胞活性檢測表明，沒有化合物可以選擇性地降低Cluster1A和1B突變ICC細胞的活性(圖6A)。與Cluster1A突變細胞相比，Cluster2A突變ICC細胞對Dasatinib、Vorinostat、JQ1、iBET、Olaparib和Niraparib表現出更高的敏感性(圖6A-B)。同時，JQ1和Vorinostat顯著抑制Cluster2A (IDH1突變)ICC細胞，但不抑制Cluster1A (KRAS/TP53突變)ICC細胞（圖6C）。這項分析表明，ICCs的分子亞型可能與特定靶向治療的獨特敏感性有關。研究人員還指出，基于ICC不同突變cluster的更大規模藥物篩選值得進一步研究。
11. 結合基因表達譜數據篩選ICCs的特異性生物標志物
綜上所述，Cluster1A和Cluster2 ICCs具有明顯的臨床特征。通過比較這兩類的基因表達數據得到了52個明顯差異表達的基因。在這些基因中，前兩個基因S100P和KRT17都是CCA生存特征和ICC復發特征的預后標記，同時也是CD特征的標記(圖7A)。研究人員構建了一個臨床病理評分(CP評分)系統，CP分數低(0和1)可以很好地定義Cluster2的ICCs，而Cluster1的ICCs大多富集于CP分數高的組中(圖7B)。該評分系統還可以將Cluster3病例分為兩個具有明顯臨床和生物學相關性的亞群（圖7C-D）。
總而言之，S100P和KRT17結合CA19-9可能作為譜系指示標記，有助于ICC突變cluster的鑒別。結合聚類突變和亞型特異性的生物標志物，研究人員最終提出了一種臨床適用的聚類策略，它可以指導ICC預后分層、分子分類和治療優化(圖8)。
結論
在本研究中，研究人員通過研究驅動基因突變的成對相關性或互斥性，揭示了ICC多樣性的突變基礎?？偠灾?，研究人員人員對篩選出的7個突變基因的進行突變檢測，結合S100P/KRT17表達和CA19-9水平的評估，是鑒定臨床和生物學上不同亞型ICC的可靠生物標志物。此外，他們還發現不同的突變cluster具有不同的腫瘤發生機制，因此藥物反應性也不同，這將為惡性腫瘤的治療提供更精確的治療策略。
