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大家好呀，今天讓我們來看一篇題為轉錄組和單細胞分析揭示免疫抑制微環境在促進膠質母細胞瘤進展中的貢獻文章，文章于今年一月發表在《Frontiers in Immunology》（IF =8.786）上，讓我們來一起學習一下吧！
一、摘要
膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）患者經常表現出嚴重的局部和全身免疫抑制，限制了免疫治療策略的療效。GBM腫瘤免疫抑制機制的建立是個體化免疫治療成功的關鍵。本研究成功地發現了GBM的免疫抑制亞型及其形成的主要細胞類型、信號通路和分子，為今后改進GBM的個性化免疫治療提供了新的線索。
二、技術路線
A、通過對TCGA-GBM和CGGA隊列基因共存、高危組和低危組得到的DEGs以及IDH1突變與野生型的比較等三個角度獲得的基因集進行功能富集分析，確定了與GBM患者預后不良相關的五個途徑。
B、構建GBM與腫瘤微環境（TME）相關的功能基因標簽。根據這些特征的活性分布，將GBM患者分為四個不同的亞型，并發現免疫抑制亞型。
C、在三個scRNA-seq數據集中驗證免疫抑制亞型的Hub基因表達，并確定了與其顯著相關的細胞類型、某些細胞類型之間的相互作用。（圖1）
三、結果
1、細胞因子-細胞因子受體相互作用是GBM的危險因素
作者對所有基因進行單因素Cox風險回歸分析，在TCGA-GBM隊列和CGGA隊列分別發現了1264、2681個基因與生存相關。取交集共86個基因，KEGG富集結果皆被前人證實過。為了進一步驗證這些基因在GBM進展中的預測作用，作者基于最小絕對收縮篩選得到8個基因并使用LASSO回歸構建風險模型。高危組患者預后較低危組差，模型預測患者生存期的AUC值在1年、3年和5年均大于0.75，表明風險模型具有較高的預測能力。在TCGA-GBM隊列中計算高、低危險組之間的差異表達基因（DEGs）并進行KEGG富集，其中細胞因子-細胞因子受體相互作用是最重要的途徑。與野生型患者相比，異檸檬酸脫氫酶(IDH1)基因在GBM患者中是一個復發性突變與良好的預后結果有關。上述高危患者中富集的、上調的通路在IDH1突變樣本中下調，這進一步驗證了他們在GBM中的促腫瘤特性。有趣的是，細胞因子-細胞因子受體相互作用再次位于IDH1突變和野生型患者之間富集通路的頂端。（圖2）
2、異質性的腫瘤微環境（TME）成分與促腫瘤途徑相關
TME由成纖維細胞、內皮細胞、周細胞、白細胞和細胞外基質組成。為了對TME進行分類，作者構建了代表腫瘤主要功能成分和免疫、間質及其他細胞群體的基因表達簽名(GES)。根據生物學背景知識從高危患者的上述上調通路中篩選出5條促瘤通路。分析5條通路與其他TME信號（如MDSC和單核細胞的基因表達標簽GES）的相關性，5條促瘤通路與其他促腫瘤或血管生成相關信號呈顯著正相關，與抗腫瘤相關信號呈顯著負相關。通過對這些TME相關特征的單因素Cox回歸分析發現大多數特征具有高HR。綜上所述，作者綜合分析了GBM的TME基因特征，發現異質性的TME成分與腫瘤促進途徑有關。
3、GES分類識別GBM免疫抑制亞型
根據所選GES在TCGA-GBM數據集中的表達活性，采用層次聚類方法將患者分為4個亞型并根據腫瘤進展(P)、免疫浸潤(IE)和兩者同時表達(P/IE)對亞型進行定義。P亞型有較高的腫瘤進展特征和較低的淋巴細胞浸潤，存活率最差。然后作者從免疫抑制、免疫檢查點阻斷（ICB）、高頻突變分布、細胞浸潤等幾個方面評價了IE和P亞型之間的差異。圖3C繪制了免疫抑制因子的表達熱圖，可以看到這些基因在亞型P中高表達；圖3D繪制了四個亞型高頻突變的分布，IDH1突變為IE型具有較好的臨床結局與上述結果一致。腫瘤細胞通常上調ICB基因表達以逃避免疫系統。圖3E繪制了抑制性ICB在P型細胞中的表達。P亞型表現為高水平的髓系細胞浸潤，其他亞型表現為高水平的淋巴細胞浸潤（圖3F）。使用CGGA數據集驗證結果與上述一致，不一致的是CGGA數據集中IDH突變不主要分布在IE型，也分布在IE/P型。總之，作者在TCGA-GBM和CGGA隊列中鑒定了免疫抑制亞型和淋巴細胞亞型，并發現了它們相反的生物學特性。（圖3）
4、GBM亞型代表了異質性的功能基因模塊
使用WGCNA識別亞型特異的功能模塊，計算模塊基因與亞型之間的相關性，P亞型特異的模塊為7、5和18；IE/P2亞型特異模塊為113；IE/P1亞型特異的模塊為10；IE亞型特異模塊為15、8和11。對亞型特異性模塊進行功能富集分析并依據P值篩選每個模塊的前5條途徑。M5富含參與炎癥反應的基因，包括細胞因子相互作用、趨化因子信號傳導和Th17細胞分化。M7富含與血管生成相關的基因。M18富含參與細胞對低氧反應和碳代謝的基因。提示這三種功能相關的基因參與了免疫抑制微環境的形成。IE/P2和IE/P1亞型均與代謝有關。IE亞型主要富集于突觸和單一轉導相關通路，這表明IE亞型的神經系統活性較高。
單因素Cox回歸分析各模塊基因表達與患者生存的關系。P<0.05、HR>1促腫瘤相關基因，HR<1抗腫瘤相關基因。促腫瘤基因比例>0.5預后不良相關模塊，抗腫瘤相關基因比例>0.5預后相關模塊。將9個亞型特異性模塊分為7個預后不良模塊和2個預后良好模塊，各亞型特異性模塊的存活相關基因縮寫為ssMSGs，對hub基因進行生存分析得到主要位于M5和M7(P亞型）的24個hub基因。通過對Hub基因在不同基因模塊中的共表達分析，確定了M5中前15個Hub基因包括LAPTM5、NCKAP1L、PTPN5、SYX和SIGLEC9，這與我們總結的危險通路一致。此外，在免疫治療隊列中這15個hub基因的特征與較差的臨床結果相關（圖4f），與M5的促瘤功能一致。值得注意的是，在單細胞數據集中，我們證實M5、M7和M15的hub基因也是特定細胞類型的標記基因。M5中的CSTS、CD68、NOD2是巨噬細胞的標志物；M7中COL6A2和ITGA5與血管細胞有關；M15中的Oligo2是少突膠質細胞的標志物。這一結果表明，在GBM的發展過程中，特異的細胞類型應該代表不同的功能模塊。（圖4）
5、巨噬細胞和小膠質細胞操縱GBM促瘤基因模塊
作者分析了3個GBM單細胞數據集(GSE117891、GSE84465和GSE163120)中9個亞型特異模塊ssMSGs的表達活性。用“AUCcell”計算單細胞中ssMSGs的表達活性。在P亞型相關基因中：M5在髓系細胞包括TAMS、小膠質細胞、單核細胞和DCs中高表達；M7主要在血管中表達；M18在血管、髓細胞和腫瘤細胞表達。IE亞型相關基因位于OPCs和神經元。結合這些結果，我們認為巨噬細胞操縱M5，血管相關細胞參與M7，而OPC細胞調節M15。（圖5A-D）
6、細胞-細胞相互作用
作者比較了腫瘤細胞與正常細胞的相互作用強度，發現在所有細胞類型中巨噬細胞都表現出與腫瘤細胞的高度相互作用；作者同時繪制了免疫細胞之間的相互作用網絡。有趣的是，當我們通過細胞因子相關途徑的表達來劃分細胞時，發現表達更高細胞因子途徑的巨噬細胞與DC和T細胞的相互作用更強，這可能強調了它們的促腫瘤機制。類似地，我們發現具有較高細胞因子途徑表達的小膠質細胞傾向于與DC，巨噬細胞，單核細胞和T細胞相互作用。Tregs與細胞因子高的亞型之間的相互作用更強，這可以重塑免疫抑制微環境。總之，我們確定了在GBM中操縱不同基因模塊的特定細胞類型，主要關注巨噬細胞和小膠質細胞與微環境中其他細胞類型的相互作用。（圖5E-F)
7、巨噬細胞和小膠質細胞通過與Tregs相互作用形成免疫抑制微環境
為了進一步確定GBM患者巨噬細胞和小膠質細胞相互作用的關鍵介質，基于配體-受體對的表達和下游靶點，作者選擇Tregs進行分析，發現巨噬細胞和小膠質細胞可以通過粘附配體-受體對ICAM1-IL2RG和ITGAM-ICAM2直接接觸Tregs。此外，巨噬細胞和小膠質細胞通過EBI3、CD86和TNF的表達增強Tregs的活化因子活性，誘導Tregs表達IL27RA、CD28、TNFRSF1B、Fas、ICOS和免疫檢查點CTLA4。 巨噬細胞和小膠質細胞通過CXCL16-CXCR6、CCL3-CCR5、CCL2-CCR5對增強Tregs的募集。然后作者評估了巨噬細胞或小膠質細胞上的哪些配體最有可能調節Tregs，合并GSE163120和GSE117891數據集確定了七個配體基因。圖6d展示了前15個hub基因與這些配體之間的調控網絡。 SPI1可能是TNF的上游調節因子，GPSM3可能調節C3、CXCL3、CXCL16和CXCL2等一系列細胞因子和趨化因子的表達。總之，作者發現上游調節因子是如何調節巨噬細胞和小膠質細胞上配體的表達的，配體是如何與Tregs上的受體相互作用的，以及這些相互作用如何形成GBM的免疫抑制微環境。（圖6）
三、小結
本篇文章結合轉錄組和單細胞數據對膠質母細胞瘤劃分亞型，并成功地定義了免疫抑制亞型，不同類型患者的生存率有統計學差異。本文有4個亮點：1、作者構建了代表腫瘤主要功能成分和免疫、間質及其他細胞群體的基因表達簽名(GES)，并利用GES進行亞型的劃分。2、使用WGCNA分析對亞型功能及形成機制進行補充。3、在單細胞驗證集中，作者利用“AUCcell”評估各亞型特異性模塊的生存相關基因活性評分，觀察這些基因在哪些細胞中表達升高，從而將細胞類型與功能模塊相聯系。4、作者通過對單細胞數據集細胞-細胞相互作用分析揭示了GBM的免疫抑制微環境的形成機制。文章脈絡清晰，得到的結論可前后相互印證，感興趣的小伙伴可以進行復現嘗試哦~
參考文獻：Ni L, Sun P, Zhang S, Qian B, Chen X, Xiong M, Li B. Transcriptome and single-cell analysis reveal the contribution of immunosuppressive microenvironment for promoting glioblastoma progression. Front Immunol. 2023 Jan 5;13:1051701. doi: 10.3389/fimmu.2022.1051701 . PMID: 36685556; PMCID: PMC9851159.
