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今天要給大家介紹一篇2021年10月份發表自Frontiers in Immunology(IF: 7.561)，在該研究中，作者使用單細胞RNA測序數據鑒定了在胃癌發展過程中不同組織微環境細胞的動態轉錄組圖譜。
A Dynamic Transcriptome Map of Different Tissue Microenvironment Cells Identified
During Gastric Cancer Development Using Single-Cell RNA Sequencing
文章簡介
在全球范圍內，胃癌(GC)是第五大最常見的癌癥腫瘤。GC的發展經歷了一個多階段的過程，從非萎縮性胃炎(NAG)到慢性萎縮性胃炎(CAG)，再到腸上皮轉化(IM)，最后是GC。在此過程中，胃黏膜組織和組織微環境（TME）發生動態變化。TME包括多種細胞類型（免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等）和圍繞上皮細胞的基質成分（趨化因子、細胞因子、生長因子等）。人們越來越認識到，TME的細胞特征在使腫瘤增殖和轉移方面發揮著重要作用。有研究表明，TME細胞不是隨機分布的，而是更多或更少的密集地分布在上皮細胞不同的區域，形成了促進腫瘤生成的復雜背景。有結果表明，癌癥中的TME細胞動力學嚴重影響疾病生物學，并可能影響對全身治療的反應。此外，TME與癌細胞之間的相互作用可以促進表型異質性、細胞可塑性和癌細胞干性，改善腫瘤的侵襲和轉移。因此，闡明TME細胞中的動態轉錄組變化對于確定與GC病因有關的機制很重要。
目前已經通過大量RNA轉錄組測序確定了GC中的TME變異。一些文獻表明復雜TME已嚴重削弱抗腫瘤免疫能力。胃黏膜固有層中浸潤的免疫炎癥細胞在GC發展過程中表現出動態變化。然而，這些分析的原理是基于每個基因在每個細胞中均等表達的假設。因此，進行傳統的RNA測序是不可能在亞群水平上研究TME細胞的異質性的。
單細胞RNA轉錄組測序(scRNA-seq)可以用于研究細胞異質性并預測和分析細胞間的相互影響。該技術在分析復雜的細胞環境和破譯疾病多個階段之間細胞的變化表現出良好的實用性。到目前為止，關于這個主題的出版物很少。在GC進展過程中TME細胞的變化尚未闡明，因此，scRNA-seq可以幫助確定特定的細胞亞群和轉錄特征以在胃病的發展中區分TME細胞。
在這項研究中，作者使用單細胞測序數據可視化了疾病多階段期間（NAG-CAG-IM-GC）幾種TME細胞類型的動態轉錄組圖。該圖譜確定了不同疾病狀態下不同TME細胞的多維特征，包括亞群、標記基因、功能通路、分化擬時、激活的轉錄因子(TF)、免疫檢查點和細胞間通訊模式等。作者的分析揭示了在GC腫瘤形成過程中，TME細胞中巨噬細胞、T、B、肥大細胞、成纖維細胞、內皮細胞和周細胞的異質性顯著增加，并有可能為GC的早期檢測、診斷和治療制定策略。
文章結果
TME細胞的表達譜和不同疾病階段的變化趨勢
為了表征胃微環境的單細胞概況，作者從NAG、CAG、IM和GC階段獲得了66,063個單細胞。質量控制后，剩余45,336個細胞。為了識別不同的細胞群，作者使用Seurat來執行降維、消除批次效應并進行無監督模塊聚類?；诮浀錁酥疚锏谋磉_，作者排除了13個上皮細胞亞群，鑒定了11個TME細胞亞群，包括T細胞（CD2和CD3D）、B細胞（CD79A）、巨噬細胞（CSF1R和 CD68）、肥大細胞（TPSAB1）、成纖維細胞（DCN和PDPN）、內皮細胞（VWF和ENG）和周細胞（RDGFRB和RGS5）（圖1A，B）。在NAG-CAG-IM-GC級聯過程中，T細胞比例顯著增加，尤其是在GC階段，B細胞和EC顯著減少。巨噬細胞、周細胞、肥大細胞和成纖維細胞在整個級聯過程中表現出輕微的波動變化（圖1C、D）。
圖1：不同的TME細胞群和表達特征
不同疾病狀態下巨噬細胞的動態多維特征
作者根據相似和差異基因表達在四個亞群（MacC1-MacC4）中鑒定了1,162個巨噬細胞（圖2A）。從CAG到IM再到GC，MacC1和MacC3的比例呈下降趨勢，MacC2呈上升趨勢，而MacC4在GC上有獨特表達（圖2C、D）。標記基因和MacC1-C4亞群功能在圖2B、2E展示。與其他細胞亞群相比，MacC1有中性粒細胞激活和抗原呈遞功能。MacC2有粒細胞活化、白細胞遷移和凋亡信號通路功能的調節。MacC3細胞參與膜上的蛋白質定位。MacC4顯示有更高的氧化磷酸化和ATP生物合成過程的表達方式。作者還鑒定了新的標記基因PLAU、S100A8、CLEC10A和TFDP2（圖2F）。這些結果表明，在NAG-CAG-IM-GC過程中，巨噬細胞亞群參與了趨化性、抗原呈遞和凋亡調控。類似地，巨噬細胞在TME中被重塑以參與氧化磷酸化和ATP產生以促進GC進展。擬時分析顯示MacC1細胞具有最低的偽時間值（圖2G），其中MacC1細胞保持不變，而一些細胞轉化為MacC2，一些經過MacC3階段為MacC4細胞。SCENIC分析顯示TFs、MSC、MECP2、BCL11A和ETS2上調，而GTF2B、CREB5、MAF、NR1H3和TCF4在轉化過程中下調。（圖2H)。
圖2：不同階段巨噬細胞組成、基因表達及功能的變化
不同階段T細胞的動態多維特征
作者根據已知的標記基因確定了四個T細胞亞群，分別稱為CD8+ T、CD4+ T、Treg和自然殺傷(NK)T細胞（圖3A、B）。在從NAG到GC階段的級聯過程中，CD8+ T和CD4+ T細胞逐漸減少并被Treg和NK T細胞取代（圖3C）。大約1,213個CD4+ T細胞被另外三個亞類所代替。因此，作者對CD8+ T、Treg和NKT細胞進行了亞組分析。
圖3：不同階段T細胞亞型多重變化的特征
如圖所示（圖3D），CD8+ T（n=2,410）細胞被分成五個亞群（CD8+ C1-CD8+ C5）。CD8+ C1和CD8+ C3亞群的比例逐漸下降，但CD8+ C2和CD8+ C4亞群的比例逐漸增加，尤其是從IM到GC，它們顯示出急劇上升的趨勢（圖3E、F）。CD8+ C5在不同階段之間沒有顯著變化。圖3G、3H顯示了CD8+ C1–CD8+ C4亞群的標記基因和功能。CD8+ C1與其他亞群相比，在免疫效應過程、白細胞活化和翻譯起始中發揮作用。CD8+ C3顯示參與具有防御反應、對生物刺激的反應和細胞因子介導的信號通路。CD8+ C2表現出對白細胞-細胞粘附、T 細胞受體信號通路和免疫反應的正向調節的功能。CD8+ C4表現出基因CXCL13、RBPJ、TRAC、LAYN和IRS2的顯著高表達（圖3I），其中CXCL13和LAYN表示T細胞耗竭。值得注意的是，抑制性檢查點基因，TNFSF4、TNFRSF9、TMIGD2、CD200、TNFSF15、TNFRSF4、TNFRSF18、HAVCR2、VSIR、TIGIT和CD70在CD8+ C4 亞群中被上調（圖3I）。這些結果表明，在正常、癌前和癌癥階段之間，一部分CD8+ T細胞被耗盡并被免疫抑制，而另一部分則主導了免疫反應的激活以抵抗腫瘤細胞。
如圖（圖4A），478個Treg細胞分為兩個亞群TreC1(FOXP3-、IL2RA+)和TreC2(FOXP3+、IL2RA+)（圖4B），其中大部分來自GC階段（圖4C）。與TreC1亞群相比，TreC2亞群中的DEG參與氧化磷酸化和Th17細胞分化過程（圖4D）。此外，這些細胞表達了幾個免疫檢查點（TIGIT、VSIR、HAVCR2、CD48、TMIGD2、CD80和CD44）和共刺激分子（TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF18、CD27、CD70和ICOS)（圖4E），表明在致癌作用中的重要作用。進一步的分析表明，SH2D1A是TreC2亞群的代表性基因（圖4B）。FOXP3和SH2D1A顯示出很強的相關性（P<0.001，R=0.7，圖4F），然而，它們之間沒有觀察到直接的相互作用（圖4G）。
圖4：Treg和NK T細胞亞群
作者將452個NK T細胞分為兩個亞型（C1和C2），其中大部分來自腫瘤組織（圖4H、I）。圖4J，4K顯示了標記基因及其功能。C1的主要功能與蛋白質定位于內質網、RNA分解代謝過程和翻譯起始（圖4K）有關，這表明了NK T細胞的活化。C2與免疫和細胞防御反應有關，表明具有抗腫瘤反應的潛力（圖4K）。一些抑制分子（TIGIT、HAVCR2、TMIGD2、CD48、CD44）和共刺激分子（TNFRSF9、TNFRSF18，TNFSF14）在這些亞群表達（圖4L）。
B細胞不同階段的動態多維特征
總共2573個B細胞被分成四個亞群(C1-C4)，其中大部分來自炎癥階段（圖5A、B）。作者發現C1和C3亞群在CAG階段逐漸增加，然后隨著疾病進展而下降（圖5C）。C4亞群只出現在GC階段。圖5D、5E顯示了標記基因及其功能。C1與對細菌的反應和消化功能有關。C2亞群參與鞘糖脂分解代謝過程和涉及內質網相關降解(ERAD)途徑負調控的過程。C3與細胞因子介導的信號通路以及對cAMP和細菌的反應有關。C4亞群參與p53對內在凋亡信號通路的正調節和泛素連接酶活性的負調節相關的功能。這些結果表明，B細胞在炎癥階段積極參與免疫反應，但在癌癥階段失去功能，有誘導細胞凋亡的趨勢。
擬時分析顯示C2細胞是具有最低偽時間值的起點。C3和C4出現在分化擬時的每一端（圖5F）。SCENIC分析表明，許多關鍵基序的活性，包括STAT3、FOXP1、TGIF1、YY1和REL被激活，而FOS、EPAS1、EGR1和JUN被抑制，從而導致C2-C4過程（圖5G）。
圖5：不同階段B細胞亞型多重變化的表征
非免疫細胞不同階段的動態多維特征
接下來，作者評估了TME中非免疫細胞的轉錄組轉換，總共有1,730個成纖維細胞根據不同的基因表達模式被分成五個亞群(FibC1-C5)（圖6A）。FibC1亞群細胞在CAG階段占主導地位，而FibC2和FibC4亞群在IM階段逐漸增加。FibC3亞群僅出現在可能與腫瘤相關的GC階段，而FibC5在所有階段細胞數都較少（圖6B、C）。圖6D顯示了所有亞群的標記基因和功能。GO分析表明對生長因子的反應在FibC1（圖6E）中高度富集，尤其是BMP4（圖6F））。炎癥反應、補體激活、細胞凋亡和蛋白水解調節過程在FibC2和FibC4中顯著更高（圖6E）。心血管發育、膠原纖維組織和細胞粘附過程在FibC3中高度富集（圖6E）。作者還觀察到新的標記基因（圖6G），其中RBP4、ABCA8和GPM6B主要在CAG階段；CST1主要出現在GC階段，NPY主要出現在IM階段（圖6H）。為了確認表達，進行了免疫熒光測定，如圖6K-N所示在胃病的不同階段，RBP4、S100A8、NPY 和CST1與傳統的成纖維細胞標記物(ACTA2)共表達。RBP4、S100A8、NPY多出現在CAG和IM期，而CST1+成纖維細胞幾乎只出現在GC期，NAG組織中幾乎不存在。
圖6：不同階段成纖維細胞亞群的鑒定和表達特征
擬時分析顯示FibC2細胞在分化最初階段，FibC3在分化最后階段（圖6I）。SCENIC分析顯示擬時趨勢可能受NR2F1、TCF21、FOXF1和SOX6表達降低的調節，而STAT1、STAT2、FOXP1、FOXO1和NR2F2表達上調（圖6J）。TF的變化可能是細胞發育機制的關鍵。
從1,115個細胞中鑒定出四個內皮細胞亞群(EndC1-C4)（圖7A）。EndC1亞群在腫瘤發生過程中逐漸減少。EndC2亞群在GC中略有增加。EndC3亞群細胞是IM的主要細胞，而EndC4亞群僅出現在GC（圖7B、C）。EndC2亞群顯示具有高度表達的線粒體基因并且沒有特定基因表達（圖7D）。EndC3亞群與TGF-β信號傳導、血管生成和EMT（上皮-間質轉化）呈負相關。EndC4集群主要與G2M檢查點、MYC和EMT進程相關（圖7E）。此外，EndC4顯示出顯著增加的趨化因子表達（CCL18、CCL3、CCL8、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL2、CXCL5、CXCL9和PPBP）（圖7F）。新的標記基因CA4主要出現在CAG階段，而DARC在IM中出現，IGFBP5主要在GC階段增加（圖7G，H）。
擬時分析顯示EndC1細胞在分化最初階段，而C3和C4亞群出現在分化的；另外兩端（圖7I）。從EndC1-C3過程中，SCENIC分析表明由PRDM1、HES1表達下調，FOXC1和NR2F2上調（圖7J）。
圖7：不同階段內皮細胞亞群和表達特征的識別
構建IM/GC的TME-上皮調控網絡
為了進一步探索TME和上皮細胞之間的相互作用，作者使用Cellchat在IM和GC階段構建了TME-上皮網絡。如圖所示（圖8A），巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞在IM階段對腸上皮細胞發揮最強作用。在GC中，巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞和周細胞發揮了最強的作用（圖8B）。此外，作者在每個細胞亞群中選擇了10個最強的LR相互作用。在IM階段（圖8C），三個TME細胞組在腸上皮細胞中均高表達B2M，TFRC和HLA-F相互作用。然而，在GC中，TME和GC細胞之間的分子相互作用發生了改變，尤其是在成纖維細胞中。成纖維細胞中高表達的COL1A1、COL1A2和COL3A1主要與GC細胞中的ITGA2、DDR1、ITGB1和CD44相互作用（圖8D）。此外，巨噬細胞和內皮細胞在GC階段分泌的細胞因子水平升高，因此，作者分析了這些細胞因子與GC細胞之間的相互作用。這些數據表明細胞因子主要與GC細胞表面的SDC1、SDC4和ITGB1相互作用（圖8E)。
圖8：TME通過LR與腸上皮細胞和癌細胞相互作用
文章小結
在這里，作者使用公共的單細胞測序數據在多疾病階段分析了各種TME細胞的動態轉錄組圖譜。作者觀察到一組與TME細胞致癌進化相關的關鍵轉變標記。其中，巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞對上皮細胞產生了相當大的影響，表明這些細胞可能是促進GC發生和發展的關鍵TME因素。
