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今天跟大家分享的是發表在Nature（IF: 49.962）上的一篇文章。T細胞浸潤程度對免疫治療響應有關鍵作用，在本篇文章中，研究者提出一種基于DNA測序估計T細胞分數的方法。T細胞受體切除環（TRECs）的缺失是T細胞成熟所需要的，其通常在V(D)J重組過程中會發生；通過對TRECs的缺失打分，研究人員就能準確估計出腫瘤中存在的T細胞數量；這個分數還能被用來預測患者對檢查點抑制劑（CPIs）的響應以及免疫逃逸機制。
Using DNA sequencing data to quantify T cell fraction and therapy response
基于用DNA測序數據量化T細胞分數和治療反應
1.從全外顯子測序（WES）數據推斷T細胞分數
T細胞多樣性是免疫系統識別外來抗原所必需的，是V(D)J重組的產物（T細胞受體基因片段重組）。T細胞受體的α-鏈是由TCRA基因編碼的，V(D)J重組的結果是將TCRA中未選擇的基因片段切除變成TRECs-TCRA，因此在T細胞內發生缺失事件。
用來推斷癌癥體細胞拷貝數變化(SCNA)的工具依賴于讀取深度比(RDR)，反映腫瘤樣本與其匹配對照之間讀取比率的對數。在TCRA中檢測到的大多數SCNA反映的是相對T細胞含量的信號，為利用這一信號來量化T細胞含量，研究者開發出T細胞ExTRECT，它使用TCRA中的改良RDR直接量化WES樣本中的T細胞浸潤(圖1a)，即TCRA T細胞分數。與來自RNA測序(RNA-seq)數據的方法不同，TCRA T細胞分數是對樣本中T細胞比例的直接量化。TCRA T細胞分數不依賴于樣本是否新鮮，冷凍或福爾馬林石蠟包埋(FFPE)。因此,T細胞ExTRECT可以適用于腫瘤或血液樣本。
2. TCRA T細胞組分的驗證
為評價T細胞ExTRECT的準確性，研究者采用五種正交方法。
首先,該研究能夠評估T細胞是否存在于某個樣本中,研究者使用自T細胞淋巴瘤和來自于HCT11的結直腸癌細胞系數據。在所有的HCT116細胞系中，T細胞組計算分數為0。相反，來自T細胞淋巴瘤的三個細胞系得分接近1。
其次，研究者使用一種基于DNA的替代方法(CDR3 V(D) J評分)來推斷免疫含量。研究者觀察到TCRA T細胞分數與CDR3 V(D) J評分之間存在顯著正相關。然而，CDR3 V(D)J評分受測序深度的限制;與CDR3區域對齊的讀取數量通常非常低。
第三，研究者利用一系列的T細胞片段模擬下一代測序數據，觀察到模擬的和計算的T細胞分數之間高度相關。基于模擬，研究者發現TCRAT細胞分數估值在覆蓋范圍上保持一致。當選擇5個CDR3覆蓋率最高的樣本并將樣本降到50個時，CDR3方法的結果發生嚴重傾斜。
第四，為進一步確認TCRA T細胞分數用于量化T細胞的準確性，研究者評估其與蘇木精和伊紅染色組織來源樣本中的TIL評分的相關性。選擇具有RNA-seq數據和組織病理學來源的TIL評分的腫瘤樣本數據，研究者評估TCRA T細胞分數、CDR3 V(D)J評分和基于RNA-seq的CD8+細胞免疫比例(TIMER，CIBERSORT等)與組織病理學得出的TIL評分進行比較(圖1b)。Danaher CD8+評分相關性最強，其次便是TCRA T細胞分數。
最后，研究者將WES的TCRA T細胞分數與RNA-seq方法直接進行比較，發現與多個免疫評分間存在顯著正相關關系，其中與T細胞相關分數相關性最強(圖1c)。
圖1. T細胞ExTRECT方法及其驗證
3. 血液中T細胞含量的影響因素
接著，研究者在匹配的對照血液WES樣本中探索T細胞免疫浸潤的關鍵影響因素。
在TRACERx10013隊列中，女性血液TCRAT細胞比例顯著高于男性(圖2a)。與肺腺癌(LUAD)患者相比，肺鱗狀細胞癌(LUSC)患者血液T細胞分數有升高的趨勢。研究者還觀察到血液中TCRA T細胞分數和匹配的腫瘤TCRA T細胞分數之間存在顯著的正相關關系(圖2 a)。這些數據表明腫瘤免疫浸潤可能影響循環血液中的T細胞水平，反之亦然。研究者在TCGA 中的LUAD和LUSC的數據中可觀察到一致結果。
為進一步研究血液T細胞分數的決定因素，研究者從血液和正常的食管上皮(PNE)組織中提取WES數據。雖然血液樣本表現出廣泛的TCRA T細胞比例水平,大多數PNE組織沒有檢測到T細胞浸潤。通過T細胞浸潤來分割PNE樣本，發現其與血液TCRA T細胞分數顯著相關(圖2 b)。因此，與腫瘤樣本相似，正常組織中高水平的T細胞浸潤可能會影響或受血液中觀察到的TCRA T細胞碎片的影響。在預測血液中T細胞比例的線性模型中，只有正常組織中的浸潤水平是顯著的;沒有基因組因素，如正常的組織突變負擔或驅動突變狀態被用于預測PNE組織中的T細胞浸潤。
為探索病毒或細菌感染對血液中T細胞水平的影響，研究者對TCGA中LUAD和LUSC的腫瘤和血液的微生物豐度進行標準化估計。微生物讀數升高的血液樣本具有明顯較高的TCRA T細胞分數(圖2c)。
在腫瘤樣本中沒有發現相應的關聯。沒有特定的病毒或細菌與血液TCRA T細胞分數相關。
4. 腫瘤T細胞含量的影響因素
接著，研究者對腫瘤組織中T細胞浸潤的影響因素進行探索。研究者基于最近發表的泛癌數據對免疫浸潤異質性的程度和可能的基因組基礎進行探究，評估了來自12種癌癥類型178個腫瘤的731個樣本的T細胞浸潤情況。
研究者將每個多樣本腫瘤分為均勻熱(所有樣本TCRA T細胞分數>0.11)，均勻冷(所有樣本TCRA T細胞分數>0.11)或異質性。不同類型腫瘤所占比例差異有統計學意義(圖2d)，其中雌激素受體陽性(ER+)乳腺癌(BRCA)腫瘤異質性最大(83%)，而LUSC腫瘤異質性最小(22%)。不同類型癌癥在免疫浸潤異質性方面存在明顯差異，比如64%的BLCA腫瘤均為免疫熱，0%均為免疫冷，而在LUAD中，37%的腫瘤均為免疫冷，25%均為免疫熱。
接著，研究者對SCNA和免疫多樣性之間的關系進行探索。研究者將分析限制在至少有三個樣本和T細胞浸潤的異質混合物的腫瘤患者中。任何兩個樣本之間的成對SCNA異質性為任一樣本中具有獨特SCNA的基因組所占比例的總和。與TCRA T細胞分數異質性較低的配對樣本對相比，TCRA T細胞分數差異較大的成對腫瘤樣本在SCNA異質性上有較大的差異(圖2e)。
為探究與免疫衰竭或激活相關的特定亞克隆SCNA，研究者在泛癌多樣本隊列中識別出30多個腫瘤亞克隆缺失或獲得相關的細胞帶，并研究特定的SCNA是否與TCRA T細胞片段的變化相關。發現12q 24.31 32亞克隆缺失與TCRA T細胞分數下降顯著相關(圖2 f)。
對TRACERx100隊列的RNA-seq分析發現，在有和沒有亞克隆12q24.31 32缺失的樣本中，SPPL3的表達差異最顯著。已發現SPPL3的缺失可增強B3GNT5酶活性，上調細胞表面鞘糖脂，進而阻礙I類HLA功能，降低CD8+ T細胞活化等。因此，以上數據表明，包括SPPL3在內的12q24.31亞克隆缺失可能是潛在的一種免疫逃避機制。
圖2. T細胞分數的影響因素
5.T細胞分數在LUAD中的預后作用
為探索T細胞ExTRECT的臨床應用，研究者在TRACERx100的非小細胞肺癌(NSCLC)數據中驗證TCRA T細胞分數的預后作用。根據TCRA T細胞分數在隊列中的平均值，研究者將腫瘤樣本分為冷熱兩種類型。在LUAD中，研究者觀察到，免疫冷腫瘤樣本數量升高的患者預后明顯較差(圖3)。在LUSC患者中，不同T細胞分數患者之間的生存率沒有顯著差異。
圖3. TCRA T細胞組分對LUAD的預后價值
6. T細胞組分對CPIs的響應
為進一步探索T細胞ExTRECT的臨床應用，研究者對T細胞組分與CPIs的臨床反應之間的關系進行探究。CPI1000+隊列包括1070例接受抗CTLA-4、抗PD-L1或抗PD-1治療的8種主要類型腫瘤患者。根據RECIST的影像學標準將患者定義為響應者或無響應者。
研究者察到應答者中腫瘤TCRA T細胞的分數顯著更高(圖4a)且免疫冷性腫瘤在無應答者中顯著富集(圖4b)。另外，TCRA T細胞分數和臨床反應之間的關聯與克隆TMB無關(圖4b)。為評估T細胞ExTRECT的有效性，研究者選擇同時包含RNA-seq和TCRA T細胞組分數據，且包括至少10個樣本的癌癥類型進行單變量meta分析(圖4c)。研究結果表明，TCRA T細胞組分、克隆TMB和CD8A表達均與CPIs反應顯著相關。
為評估腫瘤TCRA T細胞片段是否能比CD8A表達更大程度地提高對CPIs應答的預測能力，研究者評估了不同的線性模型。單克隆TMB + TCRA模型明顯優于單克隆TMB模型。當檢驗所有模型變量的顯著性時，TCRA T細胞分數比CD8A更顯著，當組合成多變量模型時，TCRA T細胞組分仍然顯著，但CD8A表達不顯著。最后，研究者評估TCRA T細胞組分在接受CPI 治療的NSCLC隊列中的預測潛力。在單變量分析中(圖4d)， TCRA T細胞分數和血液TCRA T細胞分數與CPI反應顯著相關。
這些結果表明，TCRA T細胞分數可以作為RNA-seq測量CD8+浸潤的替代品，TCRA T細胞分數增加TMB的預后價值。
圖4. TCRA T細胞分數可預測免疫治療反應
今天的內容就是這些，最后讓我來總結一下吧。研究者基于對TRECs的缺失打分，構建T細胞組分分數；T細胞組分分數與LUAD患者預后和患者對檢查點抑制劑（CPIs）的響應高度相關。本研究的核心原理是當T細胞成熟時，編碼T細胞受體的基因在可變區會發生重排，切掉部分序列；通過該區域序列丟失情況，對樣本中T細胞的豐度進行量化。該方法相對便捷，且成本較低，具有重要的腫瘤研究以及應用價值。
看了nature上的工作，小編不禁再次感嘆，自己啥時候才能想出這么精彩的思路，做出這么有創新性的假設呢。。。看來要想文章發的多，平時積累少不了啊，大家彼此共勉吧。
