本文發(fā)表在JAMA Oncology，在最近一年的影響因子: 31.777，比上一年增加了 6.978。原發(fā)性前列腺癌的管腔型和基底型具有分子特異性，在預(yù)測治療反應(yīng)方面具有重要的臨床價值，但是關(guān)于兩類亞型在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗前列腺癌（mCRPC）中未見詳細報道。通過回顧性研究634例mCRPC樣本，發(fā)現(xiàn)管腔型和基底型mCRPC患者的臨床響應(yīng)和分子特征存在相關(guān)，尤其是接受雄激素信號抑制劑（ASIs）治療后。該項研究提示，可以基于mCRPC患者活檢樣本的病理和分子特征，提示預(yù)后以及ASIs治療的潛在效果。

背景知識：

metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC)：耐去勢轉(zhuǎn)移性前列腺癌。

androgen-signaling inhibitors (ASIs)：雄激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。

方法思路：

作者使用4個mCRPC隊列的數(shù)據(jù)來評估腔型和基礎(chǔ)型從cBioPortal下載了3個隊列：Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) (n = 157)【小編介紹：cBioPortal提供了這樣一種網(wǎng)絡(luò)資源：探索，可視化和分析多維度癌癥基因組數(shù)據(jù)。查詢交互界面整合用戶的數(shù)據(jù)可以使研究者交互探索不同樣本，基因，通路的遺傳學(xué)上的改變，還可以聯(lián)系到臨床結(jié)果。這個網(wǎng)站還提供基因水平的圖形總結(jié)。多平臺的提供網(wǎng)絡(luò)可視化分析，生存分析，和軟件編程入口。直觀的網(wǎng)站交互界面使得復(fù)雜的癌癥基因組為沒有學(xué)過生物信息學(xué)專業(yè)的研究者和臨床工作者提供便利。】神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌患者的隊列來自Weill Cornell Medicine(WCM) (n = 49)。mCRPC 隊列來自East Coast Dream Team (ECDT) (n = 266) 作者還從West Coast Dream Team (WCDT)(n=162)隊列的擴展中獲得了臨床、處理過的RNA測序、變異和拷貝數(shù)數(shù)據(jù)。作者首先將基因表達水平轉(zhuǎn)換為每個樣本的基因排名，以標準化隊列中的基因。然而，一大批效應(yīng)仍然存在(補充圖1A)。因此，作者將經(jīng)驗貝葉斯框架應(yīng)用于批次校正，該框架能夠成功地消除批次效應(yīng)(補充圖1B )。

因為在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中缺乏管腔A亞型，以前用于確定原發(fā)性前列腺癌亞型的centroid-based的標準方法不能直接應(yīng)用于mCRPC樣本。因此，作者使用所有樣本的無監(jiān)督分層聚類作為一種無偏見的方法【小編介紹：分層聚類(hierarchical clustering)： 層次聚類算法按數(shù)據(jù)分層建立簇,形成一棵以簇為節(jié)點的樹。如果按自底向上進行層次分解,則稱為凝聚的層次聚類, 而按自頂向下的進行層次分解,則稱為分裂法層次聚類。凝聚的層次聚類首先將每個對象作為一個簇,然后逐漸合并這些簇形成較大的簇,直到所有的對象都在同一個簇中,或者滿足某個終止條件。分裂的層次聚類與之相反,它首先將所有的對象置于一個簇中,然后逐漸劃分為越來越小的簇,直到每個對象自成一簇,或者達到了某個終止條件,例如達到了某個希望的簇數(shù)目,或兩個最近的簇之間的距離超過了某個閾值。

分層聚類的優(yōu)點：

（1）距離和規(guī)則的相似度容易定義，限制少；

（2）不需要預(yù)先制定聚類數(shù)；

（3）在不同粒度水平上對數(shù)據(jù)進行探測,可以發(fā)現(xiàn)類的層次關(guān)系。

哪些情況下使用分層聚類?：

（1）因為層次聚類算法對時間和空間需求很大，所以層次適合于小型數(shù)據(jù)集的聚類。

（2）在不清楚數(shù)據(jù)集不清楚聚成幾類的情況下，分層聚類可以在不同粒度水平上對數(shù)據(jù)進行探測,期望能發(fā)現(xiàn)類之間的層次關(guān)系。】利用構(gòu)成PAM50簽名的典型50個基因的基因表達來識別轉(zhuǎn)移性前列腺癌亞型，已經(jīng)對乳腺癌、前列腺癌和其他癌癥進行了檢查。DNA改變和臨床數(shù)據(jù)沒有被用于聚類。DNA改變和臨床數(shù)據(jù)沒有被用于聚類。層次聚類采用nonsquared Euclidean distance方法和ward.D2聚類方法，實現(xiàn)了Ward聚類準則。根據(jù)管腔和基底型標記物表達的增加和降低，識別出的兩個簇被識別為管腔型和基底型，這些類別被用于隨后的分析。再用GSEA評估腔內(nèi)樣本和基底膜樣本中富集的途徑。

結(jié)果：

• 結(jié)果一：管腔型和基底型亞型

【小編解析：生信分析類的文章一般都會有一些固定的思路和行為模式，作者在收集完需要的數(shù)據(jù)，并做了處理。第一步就是需要確定mCRPC的管腔和基底型亞型，在這里作者先使用層次聚類確定了管腔和基底型亞型。但是怎么去證明這是正確的呢？于是作者都使用了t-SNE來把高維數(shù)據(jù)壓縮到2維空間上來證明算法的有效性。通過視覺直觀驗證算法有效性。也就衍生出結(jié)果一的思路與內(nèi)容。】

作者收集并分析了4個隊列中總共634個mCRPC樣本的RNA測序數(shù)據(jù)。圖1A描述了所有樣本中PAM50基因的表達。樣本的等級聚類確定了兩個不同的簇：一個有346個樣本(55%)的基底型組，表明基底型標記的表達較高（PTTG1,CDC20,ORC6L,KIF2C,UBE2C,MELK,BIRC5,NUF2,CEP55,EXO1,CENPF,NDC80,TYMS,UBE2T,ANLN,CCNB1,RRM2,和MKI67），管腔組288例(45%)基礎(chǔ)基因表達較低，管腔標志物表達較高至混合(ESR1,PGR,BCL2,FOXA1,CDC6,CXXC5,MLPH,MAPT,NAT1,MDM2,MMP11,和BLVRA)。對文獻中的管腔和基底型前列腺癌基因進行的基因集富集分析進一步證實，管腔基因在管腔亞型中富集(GSEA,P<0.001)。基底型基因在基底亞型中富集(GSEA,P=0.001)。作者的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移性前列腺癌中只有2個不同的簇與管腔A腫瘤的低轉(zhuǎn)移傾向相一致，與原發(fā)性前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的3個簇相反。接下來，作者檢查了被歸類為小細胞/神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(SCNC)的樣本(96個樣本缺少這些數(shù)據(jù))。59例SCNC腫瘤中，53例(90%)為基底腫瘤。然后，作者使用了t-distributed stochastic neighbor-embedding (TSNE)圖，它降低了RNA測序數(shù)據(jù)的維度，使得具有相似RNA表達譜的樣本在二維圖中彼此接近。圖1B中的tSNE圖確定了不管使用的是哪種非監(jiān)督方法，兩個主要的樣本聚類--基底樣本和管腔樣本--確認作者的分層聚類結(jié)果是相似的。然而，沿著管腔-基底軸的分布似乎更連續(xù)，而不是兩個明顯不同的亞群。SCNC腫瘤是沿著這條軸線最基本的腫瘤。大多數(shù)被歸類為管腔的SCNC腫瘤出現(xiàn)在管腔和基底交界處附近。這些結(jié)果提示mCRPC確實存在管腔亞型和基底亞型。

• 管腔亞型和基底型的分子特征

【小編解析：分子特征是癌癥生信的一個重要分析思路，也具有最重要的臨床意義。結(jié)果二中作者根據(jù)RNA測序數(shù)據(jù)富集的通路，以及關(guān)鍵前列腺癌致癌基因和腫瘤抑制基因的突變和拷貝數(shù)變化，評估了這兩組之間的分子差異。作者使用GSEA來分析通路，并得出結(jié)論：雄激素反應(yīng)途徑是管腔型富集最顯著的途徑。另外，其中關(guān)鍵前列腺癌致癌基因和腫瘤抑制基因的變化建立在如此龐大的數(shù)據(jù)上，其可信度不言而喻。】

GSEA (Figure 2A和2B)確定雄激素反應(yīng)途徑是管腔型富集最顯著的途徑，與之前發(fā)表的原發(fā)性前列腺癌數(shù)據(jù)和基底細胞癌SCNC一致。

基底型富集最顯著的通路為細胞周期和細胞分裂有關(guān)，這與增殖基因(如mki67)的表達增加一致。然后，作者檢測了前列腺癌中3個最常突變或拷貝數(shù)改變的腫瘤抑制基因(PTEN、RB1和tp53)和癌基因(AR、FOXA1和myc)的體細胞突變和拷貝數(shù)(Figure 3)。

作者在基底型樣本中發(fā)現(xiàn)了明顯更高的2rb1改變率。PTEN和TP53缺失在兩種類型中，無明顯差距。在檢查主要前列腺癌致癌基因時，作者發(fā)現(xiàn)foxa1在基底腫瘤中有顯著較高的變化率。與myc相比，AR無顯著差異。

• 管腔亞型與基底亞型的生存差異

【小編解析：生存差異與臨床息息相關(guān)，也是生信分析與臨床相聯(lián)系的紐帶。目前，大多數(shù)文章都會使用Cox比例風(fēng)險模型，或者KM生存曲線來進行生存分析。在這里作者使用Cox比例風(fēng)險模型分析患者接受了雄激素信號抑制劑(ASI)治療，比較了管腔亞型和基底亞型之間的生存情況。】

接下來，作者檢查了80例ECDT患者和123例WCDT患者的總生存期、亞型和首次活檢后治療。在ECDT隊列中檢查的所有患者均為紫杉素原，并在活檢后接受了一線ASI治療。在Cox比例風(fēng)險分析中，ECDT中管腔型腫瘤患者的總生存期優(yōu)于基底型腫瘤患者，中位總生存期為33.1個月，中位總生存期為18.7個月。在WCDT隊列中，有活檢后接受ASI治療和非ASI治療的患者。在ECDT中，與基底腫瘤相比，腔內(nèi)腫瘤活檢后ASI治療的總生存期更好，中位總生存期為21.7個月，而基底腫瘤為32.0個月。但在未接受ASI治療的患者活檢后，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Figure 4B)。

在腔內(nèi)腫瘤患者中，作者發(fā)現(xiàn)使用ASI治療的患者生存率明顯優(yōu)于未使用ASI治療的患者。而在基底部腫瘤患者則不再顯著。提示ASI治療對腔內(nèi)腫瘤的療效可能高于基底腫瘤。接受活檢后ASI治療的ECDT患者和WCDT患者的中位總生存期相似。因此，作者合并了2個隊列進行Cox比例風(fēng)險交互分析，并對活檢前ASI治療暴露進行了調(diào)整。作者發(fā)現(xiàn)與真正的預(yù)測性生物標志物相一致，亞型和活檢后ASI治療之間的交互項具有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)作者對早期ASI治療的隊列進行亞組分析時，在從未接受過ASI治療的患者中，腔內(nèi)腫瘤患者比基底腫瘤患者有更好的總生存率。然而，當(dāng)作者檢查之前接受ASI治療的患者時，腔內(nèi)腫瘤和基底腫瘤之間的差異消失了。

• 亞型變異

【小編解析：作者下載的數(shù)據(jù)分析中還有633名患者中有關(guān)于轉(zhuǎn)移部位的信息。作者開發(fā)一個相似性評分，發(fā)現(xiàn)活檢部位的luminal-basal評分有顯著差異（補充圖2）。】

在所有4個隊列的633名患者中有關(guān)于轉(zhuǎn)移部位的信息。

在進一步的兩兩比較中，與原發(fā)部位的樣本相比，淋巴結(jié)樣本中l(wèi)umal -basal評分顯著增加，表明更基底樣的樣本。這一結(jié)果與作者的發(fā)現(xiàn)一致，即基底亞型具有更強的侵襲表型。FHCRC隊列是一個快速尸檢隊列，對每個患者的多個腫瘤部位進行了分析。這個獨特的數(shù)據(jù)集允許對亞型的個體內(nèi)變異進行分析。Figure 5描述了FHCRC隊列患者之間和患者內(nèi)部的luminal-basal評分的變異性。42例患者中只有7例(17%)同時存在腔內(nèi)和基底型腫瘤，這表明這些亞型在個體患者中相對穩(wěn)定。

本文小結(jié)：

這些發(fā)現(xiàn)代表了迄今為止對mCRPC樣本進行的最大的綜合臨床、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組分析，并且是基于腫瘤分子信息更好地為mCRPC患者提供個性化治療的重要一步。