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今天給大家帶來一篇成纖維細胞與胃癌免疫微環境相關的生信分析，研究思路設計精美，這就給各位解讀一下！
文章“成纖維細胞衍生的LPP作為胃癌治療反應和治療靶點的生物標志物”發表在《Mol Ther Oncolytics》，影響因子7.2分。
背景介紹
尋找到導致癌癥患者之間免疫檢查點抑制劑，如PD-1，PD-L1治療差異的原因，一直是眾多論文的點睛之筆。
腫瘤微環境與基因組異常改變聯合分析，可以體現出不同亞組癌癥患者之間的異質性。
3、融合基因，是指兩個或者多個基因聯合起來，一起轉錄形成一個轉錄本。這個過程一般由于染色體易位、缺失等原因所致。慢性粒細胞白血病，其分子生物學特征就是檢測到BCR-ABL融合基因，該融合基因翻譯出的融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，會導致細胞過度增殖、細胞凋亡受抑制。
3、脂質瘤首選伴侶 （lipoma preferred partner， LPP） 在既往研究中被鑒定為高遷移基團蛋白（高遷移基蛋白， HMGI-C）和混合血統白血病 （mixed lineage leukemia， MLL）的融合基因。LPP與HMGI-C的融合蛋白的表達會使NIH3T3細胞的惡性轉化。[1][2][3]
結果展示
GC中PD-L1和IFN-γ相關亞群
GC中PD-L1-和IFN-γ相關亞群
公共數據庫入選的胃癌隊列有，TCGA-STAD （n = 350）、GSE26899 （n = 93）、GSE26901 （n = 109）、GSE66229 （n = 300）和GSE28541 （n = 40），共計892個胃癌樣本。作者首先估計了腫瘤樣本中22種免疫細胞類型的豐度，發現七個類型的免疫細胞（CD8 + T細胞，激活CD4 +記憶T細胞，濾泡輔助T細胞，γδT細胞，激活NK細胞，M1 巨噬細胞，中性粒細胞）與PD1存在正相關，四個類型的免疫細胞（漿細胞，CD4 + 記憶T細胞，調節性T細胞，和M2巨噬細胞）與PD-L1表達水平呈負相關 （圖1A）。作者接下來選擇對IFN-γ進行同樣的相關性分析，（IFN-γ是PD-L1轉錄誘導因子，由活化的T和NK細胞分泌），結果發現IFN-γ與免疫細胞的相關性分析結果與PD-L1具有一致性（圖1B）。
然后，作者通過機器學習算法（LASSO），對5個隊列中PD1和IFN-g表達水平相關的免疫細胞進行排序。鑒定出7種最相關的免疫細胞，包括靜息CD4 +記憶T細胞、活化CD4 +記憶T細胞、γ δ T細胞、單核細胞、M1巨噬細胞、靜息肥大細胞和中性粒細胞。作者選擇7種免疫細胞浸潤腫瘤的豐度對胃癌患者進行無監督聚類分層。結果顯示，胃癌患者被分為三個不同的亞組，分別為亞組A、B和C （圖1C）。值得注意的是，在胃癌A組中激活CD4 +記憶T細胞有較高的浸潤比例，亞組C則有較高的靜息CD4 +記憶T細胞。另外，PD-L1和IFN-γ的表達水平在三個亞組中都顯著不同，從A亞組到C亞組逐漸下降（圖1D和1E）。生存比較分析顯示，A亞組患者預后最差，而C亞組患者預后最好（圖1F）。
GC中PD-L1-和IFN-γ相關亞群的基因組特征
GC中PD-L1-和IFN-γ相關亞群的基因組特征
作者對由上一步得到的亞組分型的突變數據進行進一步分析。不同亞組之間的腫瘤突變負荷存在顯著差異，A亞組的腫瘤突變負荷水平最高，C亞組的腫瘤突變負荷最低(圖2A)。分別取三個亞組中突變頻率最高的10個基因取交集，結果發現五個基因（TTN、TP53、MUC16、CSMD3和LRP1B）在三個亞組中具有較高的突變頻率（圖2B）。作者還繪制了瀑布圖示每個亞組中突變頻率最高的基因(圖2C-E)。在所有三個亞組中，TTN和TP53是最常見的錯義突變。其中，亞組A的ARID1A移位突變和PIK3CA錯義突變均多于其他兩個亞組。B亞組和C亞組中，MUC16錯義突變更普遍。值得注意的是，A亞組中有同時突變發生率最高，如PIK3CA和ARID1A突變（圖2F），而在B亞組中存在更多的互斥突變事件（如ARID1A和TP53）（圖2G）。在C亞組中，大多數突變事件是相對獨立的，沒有交互作用(圖2H)。
另外，PD-L1和IFN-g的表達水平、腫瘤突變和生存結果在A亞組和C亞組顯著不同。A亞組17q21.31區（BRCA1）、4p16.1區（WDR1）擴增顯著，3p14.2區（FHIT）缺失。C亞組1p31.1區（NEGR1）、3q29區（ATP13A4）擴增，17p11.2區（FAM106A、USP32P2、CCDC144B）缺失。A、C亞組的之間進行差異基因表達分析，分別發現339、375個基因在兩組顯著上調。富集分析顯示，A亞組中上調的基因在抗原加工提呈、免疫細胞分化等免疫活性相關通路中富集，而C亞組中上調的基因則富集包括礦物質吸收和胃酸分泌在內的消化代謝途徑。
PD-L1- and IFN-γ-associated risk score for prognostication in GC
PD-L1-和IFN-γ相關風險評分對GC預后的影響
作者從上述A、C亞組差異表達基因中，通過Cox回歸分析篩選出45個預后相關基因，其中保護性基因14個，危險性基因31個。然后利用LASSO算法篩選出9個有利基因和5個風險基因作為最佳特征基因（圖3A）。
最終的風險評分是根據簽名基因的表達及其系數制定的。根據風險評分的最佳臨界值將患者分為生存結局明顯的低危組和高危組(圖3B和3C)。生存比較顯示，低危組的生存結果明顯優于高危組。作者還使用另一個數據集GSE26899驗證了風險評分的分層有效性，并發現了類似的結果（圖3D和3E）。
LPP as a hub node in PD-L1- and IFN-γ-associated lncRNA - miRNA-gene regulatory network
LPP作為PD-L1和IFN-γ相關的lncRNA - miRNA基因調控網絡的樞紐節點
作者接下來構建了一個PD-L1-和IFN-γ--相關的lncRNA - miRNA基因調控網絡，并從這個復雜的機制網絡中識別出關鍵分子。作者發現共有59個miRNA和19個lncRNA在A和C亞組之間存在異常表達(圖4A)。圖4B顯示了來自三個數據庫(即miRTarBase、miRDB和TargetScan)的異常表達的miRNA和mRNA之間的預測調控關系(miRNA-gene)。合并StarBase數據庫中的lncRNA-miRNA數據，得到最終的lncRNA-miRNA-基因調控網絡 (圖4C)。基于網絡拓撲結構，作者確定LPP基因為該網絡的樞紐節點。核心的子網如圖4D所示。值得注意的是，作者發現LPP的表達從A亞組到C亞組開始逐漸下降(圖4E)，這與PD-L1和IFN-g的表達類似。高危組LPP表達高于低危組(圖4F)。提示LPP可能在胃癌的發生發展過程中起重要作用。
High expression of LPP is an independent risk factor for poor prognosis in GC
LPP高表達是胃癌預后不良的獨立危險因素
TCGA泛癌探索LPP的轉錄水平(圖5A)。結果顯示LPP在4種腫瘤類型中顯著上調，在9種惡性腫瘤中顯著下調。LPP在胃癌中顯著過表達。獨立數據集GSE66229和GSE29272中也發現了一致的結果(圖5B和5C)。通過采用Maximally selected rank statistics算法，作者根據LPP表達水平將患者分為兩組(圖5D)。生存比較發現，LPP高表達組的生存率低于LPP低表達組(圖5E)。在另外兩個數據集GSE62254和GSE84437中也發現了類似的結果(圖5F 5G)。多因素Cox回歸分析顯示，在上述3個數據集中，LPP高表達是胃癌患者預后不良的獨立因素。
Fibroblast-derived LPP associates with tumor progression and resistance to chemotherapy and immunotherapy in GC
成纖維細胞來源的LPP與胃癌的腫瘤進展和化療和免疫治療的耐藥性有關
作者還使用HPA數據庫，采用胃癌免疫組化結果，觀察LPP蛋白在胃癌中的表達。LPP蛋白在腫瘤組織間質成纖維細胞中高表達，而在正常胃組織中幾乎未見表達。作者還發現高LPP表達與腫瘤實體中纖維母細胞浸潤增加相關(圖3B)。LPP的表達與6個成纖維細胞標志物呈正相關，這些標志物用于成纖維細胞的鑒定。如前文所述，LPP在CD4 +活化記憶T細胞高浸潤的A亞組中表達增高，患者的預后差。在C亞組中表達降低，表現為靜息CD4 +記憶T細胞浸潤率高，預后較好。在本研究中，作者發現LPP高表達與激活的CD4 +記憶T細胞浸潤水平以及較低的靜息的CD4 +記憶T細胞浸潤水平相關。
為了進一步驗證成纖維細胞來源LPP的表達及其在胃癌進展的過程中，作者臨床收集15對臨床標本，采用免疫組化染色法驗證LPP蛋白的表達。結果顯示LPP蛋白在腫瘤炎癥中高表達。(圖6A和6B)。此外，作者由增加單細胞分析來豐富結果，結果顯示LPP在成纖維細胞中顯著富集 (圖6C和6D)。連續組織切片染色顯示LPP蛋白在成纖維細胞中受限表達，并且與內皮細胞標志物CD34等分布明顯不同(圖6E)。為了進一步評估纖維母細胞來源的LPP在GC發展中的作用，我們建立了穩定的LPP敲除成纖維細胞細胞系，用于體內腫瘤生長實驗(圖6F)。結果顯示，注射GC細胞混合LPP敲除成纖維細胞的小鼠，其腫瘤體積比注射癌細胞混合對照的小鼠小(圖6G和6H)。這些結果表明，成纖維細胞來源的LPP與胃癌的腫瘤生長有關。
為了研究成纖維細胞來源的LPP表達對化療反應的影響，作者使用TCGA-STAD數據集評估GDSC數據庫中四種臨床使用的化療藥物(順鉑、多西他賽、吉西他濱和紫杉醇)的半最大抑制濃度(IC50)值。結果顯示LPP高表達患者四種化合物的IC50值均高于LPP低表達患者，提示LPP高表達患者基于化療對這些化合物的敏感性較低(圖7A 7D)。通過使用另一個數據集GSE62254，我們驗證了LPP高表達的患者比LPP低表達的患者獲益更少，無論是否在化療的條件下(圖7E 7H)。這些結果提示LPP高表達的GC患者對當前化療方案的反應較低。然后，作者進一步使用GEO胃癌數據集，包括45名接受免疫治療的胃癌患者，研究了LPP表達與免疫治療反應的關聯。結果顯示LPP在反應患者中的表達低于無反應患者(圖8A和8B)。LPP高表達的患者比LPP低表達的患者反應更低(圖8C)。作者還對另一個包含26名接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者的隊列進行了驗證，也獲得了類似的結果 (圖8D -F)。
此外，作者計算了腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)評分，以預測TCGA-STAD隊列中胃癌患者對免疫檢查點封鎖的反應。結果顯示，LPP高表達患者的TIDE評分高于LPP低表達患者(圖8G)。根據患者的TIDE評分，將患者分為有響應者和無響應者兩組(圖8H)。我們發現高表達LPP組的有效率低于低表達LPP組(圖8I)。這些結果表明，LPP的高表達可增加胃癌患者的免疫逃逸和免疫治療抵抗的能力。
Underlying chemical compounds sensitive to GC patients with high LPP expression
LPP高表達的GC患者敏感的基礎化合物
通過GDSC數據庫，作者進一步探索了對LPP高表達GC患者敏感的潛在化合物。根據每個TCGA-STAD樣品中138個化合物的IC50值，共有28個化合物被鑒定為GC患者高LPP表達的敏感藥物。這些化合物靶向于參與腫瘤發生的典型通路，如IGF1R、JNK和p38、PI3K/MTOR、細胞周期和凋亡調控信號通路。作者的發現有助于胃癌治療的藥物，并建立與化療和免疫治療聯合對抗耐藥性的靶。
總結
本篇范文，作者在5個胃癌公共數據集中找出與PD-1以及IFN-γ分子最相關的免疫細胞，根據這些免疫細胞的豐度，對TCGA胃癌患者進行聚類分型，再走后面的差異基因，預后模型套路。數據集是固定的，作者只討論了胃癌，其它癌種，更換一下也可復現哦！
1. Petit MM, Fradelizi J, Golsteyn RM, et al. LPP, an actin cytoskeleton protein related to zyxin, harbors a nuclear export signal and transcriptional activation capacity. Molecular biology of the cell. 2000;111:117-129.
2. Dahéron L, Veinstein A, Brizard F, et al. Human LPP gene is fused to MLL in a secondary acute leukemia with a t(3;11) (q28;q23). Genes, chromosomes & cancer. 2001;314:382-389.
3. Fedele M, Berlingieri MT, Scala S, et al. Truncated and chimeric HMGI-C genes induce neoplastic transformation of NIH3T3 murine fibroblasts. Oncogene. 1998;174:413-418.
