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十月份發表在《nature communication》上的一篇關于神經內分泌癌（NEC）的研究，根據神經轉錄因子ASCL1和NEUROD1的表達，揭示了兩種不同的NEPC亞型，雖然在細胞系和人類腫瘤抑制模型（PDX）中，這些亞型是相互排斥的，但對人類臨床樣本的單細胞分析顯示出更復雜的腫瘤結構，亞型在同一腫瘤中作為獨立的亞群共存。這些腫瘤亞群在遺傳和表觀遺傳上的差異導致了人類轉移瘤內和腫瘤間的異質性，這一研究可以有效的為臨床提供更有效地治療策略。
摘要：
神經內分泌癌(NECs)是一種高級別腫瘤，可發生在肺、結腸、前列腺或膀胱等解剖部位。NECs的特點是侵襲性臨床行為和不良預后。在組織形態學上，NEC包括一組具有小細胞癌特征的腫瘤，并表現出神經內分泌(NE)標志物，包括SYP、CHGA和INSM12的表達。鑒于這些共同特征，NECs構成了獨特的臨床病理實體，盡管它們的解剖學起源不同。從遺傳學的角度來看，NECs通常以RB1和TP53的基因組的畸變為特征。
默克爾細胞癌(MCC)：RB1和TP53改變與NEC病因的關聯在默克爾細胞癌(MCC)中得到了證實。MCC通常是由默克爾細胞多瘤病毒DNA的克隆整合引起的，這導致病毒T抗原的持續表達，干擾RB14 (MCC多瘤病毒陽性)。
胃腸道神經內分泌癌：胃腸道NEC (GINEC)通常也含有TP53和RB1改變，與分化良好的胃腸道類癌相比，在臨床上具有侵襲性和高增殖性，雖然也顯示神經內分泌表型，但在臨床上通常是惰性的，與TP53和RB1改變無關。NEC可以是新生的，也可以是治療壓力的結果。
小細胞肺癌：小細胞肺癌(SCLC)最常發生在新生階段，但也可在EGFR突變型肺腺癌(AD)治療后出現。根據基本螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子(TFs) ASCL1和NEUROD17的差異表達，SCLC被進一步分類。這些神經元譜系的TFs (LTFs)與lung8,9的常駐NE細胞的成熟有關。它們也參與了致癌過程，如SCLC小鼠模型所示，其中ASCL1是腫瘤形成所必需的。
神經內分泌前列腺癌：神經內分泌前列腺癌(NEPC)最常作為一種治療突發性表型出現，在前列腺ADs治療后抑制雄激素受體(AR)通路活性，并且很少發生新生。NEPC預后差，治療選擇非常有限，目前作為同質疾病治療。
在這里，我們展示了一系列NECs的染色質譜，并確定收斂到一個共同的表觀遺傳狀態。發現在治療緊急的NEPC中存在與新發SCLC中所描述的一致的亞型。在相同的人類NEPC標本中，這些亞型作為具有不同染色質狀態的獨立亞群共存。觀察到的臨床NEPC樣本的腫瘤內異質性具有治療意義。
結果：
神經內分泌癌NECs有一個共同的DNA可訪問區域
(FIG1)
在組織形態學上，NECs表現出相似之處，這可能是由共同的轉錄調控因子激活引起的。為了研究染色質可及性對NEC表型的影響，研究人員利用高通量測序(ATACseq)和RNA測序(RNA-seq)分析在不同解剖位置產生的NECs的表觀遺傳格局，并將其應用于患者的NEPC、SCLC和MCC異種移植(PDX)模型，以及GINEC的臨床樣本。由于NEC可以從既存的腺癌中產生，以NEPC為典型，偶爾也有SCLC，我們假設這些組織學是腫瘤進展譜的極端。為了通過ATAC-seq分析確定神經內分泌癌和腺癌之間染色質狀態的差異，我們還生成了轉移性前列腺癌 (PRAD) PDX模型的數據，并使用了癌癥基因組圖譜數據用于原發性PRAD和非小細胞肺腺癌。對ATAC-seq數據進行的無監督主成分分析(PCA)顯示，與解剖位點分離的腺癌相比，NECs聚類在一起，表明染色質處于收斂狀態(圖a)。為了驗證這一結果，研究人員還分析了之前發表的ATAC-seq結果，這些結果來自于表達特定致癌驅動程序集的工程細胞，這些細胞將正常基底前列腺細胞重新編程為NE狀態。數據集的ATAC-seq峰的樣本樣本相關性也支持這樣的結果，即來自同一組織的NECs彼此之間比它們的腺癌對應物更相似(圖b)。為了研究參與NE染色質狀態的表觀遺傳驅動因素，研究人員對腺癌和NECs之間的DNA可及性進行了監督分析，發現腺癌和NECs之間的DNA可及性較高，并發現所有神經內分泌腫瘤類型共享的特異性可訪問位點(圖c)。在前列腺細胞中也可以看到nec特異性染色質標記，在神經內分泌特異性可達位點上信號明顯增加，而在腺癌特異性位點上信號很少或沒有。我們還確定了與每個位點最近的基因，并將ATAC標記翻譯成RNA-seq標記，發現我們可以在患者隊列中區分去雄抵抗前列腺癌(CRPC)和NEPC，進一步驗證了PDX模型的簽名。
通過基因組區域富集注釋工具(GREAT)分析，將基因組區域與附近的基因關聯起來，然后檢測基因本體(GO)路徑的富集，進一步研究了腺癌和NECs之間染色質組織的主要差異。神經內分泌特異性dna可達區域附近的基因在神經分化、發育、形態和軸突發生的通路上顯著富集(圖1d)。接下來，研究人員使用HOMER研究了富集TF dna結合基板的特異性位點。該分析顯示，bHLH TF家族的基本基元顯著富集，特別是對ATOH1、ASCL1和NEUROD1，以及對NFIB、SOX2和NKX2-1基元顯著富集(圖e)。而ASCL1和NEUROD1則被認為在sclc中具有相應的作用。NFIB是一種TF，此前與SCLC22的染色質結構重組有關，而SOX2和NKX2-1也已知與sclc有關。研究ATAC-seq峰中哪些基元共同出現，我們觀察到三個主要基元模塊(ASCL1、ATOH1和NEUROD1)與SOX2或NFIB或兩者同時出現的情況非常頻繁。通過將神經內分泌特異性位點與cisstromeDB中已發表的染色質免疫沉淀測序(ChIP-seq)譜進行比較，確定了已發表的結合位點與GIGGLE評分所量化的神經內分泌特異性ATAC-seq峰重疊程度最高的TFs。與觀察到的NECs共享表觀遺傳程序一致，頂部重疊的ChIP-seq數據集來自SCLC、MCC或神經譜系(圖f)。特別是，ASCL1 (SCLC)、NEUROD1 (SCLC和髓母細胞瘤)和MAX (MCC)的結合譜與神經內分泌特異性可及染色質重疊評分最高(圖1f)。接下來，研究人員分析了在研究樣本中這些tf和其他nec相關因子的表達。正如預期的那樣，研究人員觀察到NE標記(SYP, CHGA和INSM1)和莖干TF SOX2(圖g)在NECs中的表達有很強的共性。研究人員還觀察到在NEPC和SCLC中包括ASCL1或NEUROD1在內的bHLH TFs的更互斥的表達模式，GI-NECs中ASCL1和ASCL2的表達，MCC中ATOH1的表達(圖g)。總的來說，研究人員的研究結果表明腫瘤和器官特異性bHLH轉錄因子維持著常見的NE表觀遺傳狀態。
治療后的NEPC可根據ASCL1和NEUROD1的表達進行細分
(FIG2)
為了探索轉錄因子(TF)調控NEC表觀遺傳狀態的異質性，研究人員對局限于NECs的ATAC-seq數據進行了無監督分析。SCLC和NEPC在DNA可及性方面的相似性取決于ASCL1或NEUROD1表達的狀態，而不是腫瘤類型。僅在前列腺樣本中對DNA可及性的無監督分析(圖a)顯示出與AR(所有神經內分泌前列腺癌)、ASCL1或NEUROD1表達相關的明確聚類分組，通過分析這些相同前列腺樣本的RNA-seq數據也可以看出相同的聚類。接下來，我們旨在鑒定與ASCL1和NEUROD1 NEPC亞型相關的差異DNA。通過監督分析比較表達NEPC的ASCL1和NEUROD1樣本，發現了8950個ASCL1-和12751個NEUROD1-特異性可及區域(圖b)。接下來，我們調查了SCLC中的NEPC亞型特異性位點，并在這些tf特異性基因組區域觀察到類似的染色質可及性模式，此外，還發現染色質狀態與ASCL1和NEUROD1的差異表達之間存在關聯。值得注意的是，ASCL1和NEUROD1共同表達的SCLC病例在兩組區域顯示聯合可達性。這一結果強調了腫瘤亞型的染色質狀態的驚人相似性，包括SCLC和NEPC。值得注意的是，盡管這兩種亞型在可及性方面存在明顯差異，但鑒于兩種亞型具有共同的NE特征，正如預期的那樣，這兩種亞型之間仍有大量的開放染色質位點共享。
為了進一步研究不同亞型間的染色質差異，我們研究了TF亞型特異性染色質可及性與ASCL1和NEUROD1基因組結合之間的關系。差異染色質可及位點被相應的TF結合，而不是被另一個TF結合(圖b)。這一結果與ASCL1和NEUROD1在各自亞型中維持染色質狀態的作用一致。接下來，研究人員利用來自相同樣本的表達數據，試圖確認針對ASCL1和NEUROD1亞型的增強子與附近基因的表達相關(圖c)。正如預期的那樣，差異表達分析顯示ASCL1是ASCL1組中上調最多的基因之一，而相反，NEUROD1組顯示包括NEUROD1/2/4/6在內的多個NEUROD家族成員上調(圖c)。與這些差異可及區域的功能一致，觀察到差異DNA可及性和差異基因表達之間存在顯著關聯(圖c)。基因集富集分析以識別兩種亞型中不同程度過度表達的通路，結果顯示ASCL1相關的基因表達在細胞因子28反應的GO通路中富集，而neurod1相關的表達在腦發育通路中富集(圖d)。在ASCL1亞型中特別富集的是癌胚抗原相關細胞粘附分子(CEACAM1,5,6,7)。有趣的是，CEACAM5已經被研究使用一種antieacam5 - sn38抗體偶聯劑靶向NEPC。此外，與NEUROD1亞型相比，ASCL1亞型表現出相對較高的主要組織相容性復合體i相關基因(人類白細胞抗原基因，NLRC5)的表達，這可能有助于富集與ASCL1相關的免疫途徑。然而，相對于CRPC中的表達，其表達仍然很低。因此，與其他NECs類似，這兩種亞型NEPC均表現出相對較低的抗原提呈途徑表達。ASCL1和NEUROD1轉錄因子與自身啟動子和附近增強子的結合表明，它們在NEPC中作為LTF發揮作用。已知LTF通過與超級增強子(SEs)結合建立一個正反饋循環來自動激活自己的表達。此外，LTFs形成核心tf的回路，由促進維持譜系所需的轉錄程序的SEs激活驅動。ASCL1和NEUROD1都是已知的神經系統轉錄因子。調查的潛在LTF行為都在NEPC TFs,我們執行SE分析由ASCL1 H3K27ac剖析和NEUROD1 NEPCs,并發現所有的模型顯示,常見的TFs SE激活各種腫瘤亞型(圖e)。此外,我們發現ASCL1或NEUROD1(以及其他家族成員)的不同SEs與它們的表達狀態一致。基于這些特點,ASCL1和NEUROD1都可以被視為LTFs與綁定NEPC SEs并激活自己的表達式(圖c、f)。接下來，我們使用前面描述的方法識別相互關聯的自動調節回路，識別與兩個子類型各相關的tf的核心電路。我們在這兩種亞型中發現了不同但高度重疊的TF通路(圖g)。綜上所述，我們的結果為NEPC模型系統中存在兩種分子亞型提供了明確的證據。這些亞型具有相同的NE表型特征，但ASCL1和NEUROD1的表達不同，這與不同的染色質結構和基因表達譜有關。
NEPC肝轉移瘤的異質性分析
(FIG3)
接下來，研究人員為了去確定模型系統的結果是否可以擴展到人類臨床NEPC。首先調查了兩組NEPC轉移腫瘤組織中ASCL1和NEUROD1的表達水平。與之前在NEPC PDXs中觀察到的兩個TFs相互排斥的表達相反，臨床樣本顯示了一系列的共表達。在大多數轉移灶中ASCL1表達較高，同時幾乎所有病例中NEUROD1表達較低且更多變(圖a)。臨床NEPC樣本中TFs的差異表達與我們比較ASCL1和NEUROD1 NEPC模型中識別的相應基因標記的富集有關。
為了研究這些tf是否在相同的腫瘤細胞或不同的腫瘤亞群中共同表達，研究人員研究了5個不同的肝轉移(FLMs)片段，這些片段來自于一名確診為NEPC的患者的尸檢，可用最佳切割溫度化合物冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋材料，并使用RNAseq來評估ASCL1和NEUROD1的表達水平。這些水平顯示了兩種TFs的共表達范圍，其中FLM3顯示了NEUROD1與ASCL1的最高相對表達。接下來，對FLM3上的ASCL1和NEUROD1蛋白表達進行免疫組化(IHC)分析。ASCL1和NEUROD1染色顯示了腫瘤內的異質性，定義了兩個分離的腫瘤群體，它們存在于腫瘤切片的不同部位(圖b)。這兩種亞型都表現出NE表型，其特征是NE標記INSM1的表達和AR表達的缺失。與組織形態學特征的相關性表明，兩種不同的細胞群在組織學特征上也存在差異。ASCL1陽性細胞呈片狀生長和梭形細胞形態，而neurod1陽性細胞似乎生長在更小的細胞簇中，具有明顯的核模塑和局灶多形性巨細胞(圖c)。研究人員將IF分析擴展到另外6個NEPC樣本，也觀察到存在相同類型的腫瘤內異質性，沒有ASCL1和NEUROD1共表達。
接下來，研究人員通過單細胞染色質(scATAC-seq)和表達(單核RNA測序(snRNA-seq))分析研究了兩個觀察到的腫瘤內群體。選擇NEUROD1表達最高的FLM3和表達最低的FLM5，幾乎是ASCL1的200倍。從FLM3冰凍切片中分離細胞核，并進行scATAC-seq和snRNA-seq，將ASCL1和NEUROD1的表達與相應的染色質狀態聯系起來。scat -seq的無監督t分布隨機鄰居嵌入(tSNE)聚類生成多個聚類，分析了在SOX2啟動子上的差異可及性，以區分腫瘤細胞和正常細胞。根據對SOX2的可及性，腫瘤細胞的比例約為80%。值得注意的是，可以根據ASCL1和NEUROD1啟動子的不同可及性來區分對應于兩種腫瘤亞型的簇。ASCL1和NEUROD1簇在大容量分析確定的最高ATAC差異區域也顯示出不同的可及性。另外一組由在ASCL1或NEUROD1啟動子處顯示可訪問性但混合的細胞組成;我們將該簇標記為混合。接下來，我們分析snRNA-seq以識別表達ASCL1和NEUROD1的腫瘤細胞，然后使用SEURAT34將該數據集與scATAC-seq整合(圖d)。這種整合可以基于特定標記的表達來分配正常的細胞。至關重要的是，從大量數據發展而來的具有ASCL1或NEUROD1可及性特征的細胞優先表達相應的TF(圖d)。結果表明，ASCL1和NEUROD1亞型作為獨立的亞群體存在，與它們各自的模型系統中具有相似的表觀遺傳特征。接下來研究人員研究了FLM5樣本，它通過scATAC-seq分析具有最高的ASCL1表達。根據RNA-seq, tSNE分析顯示，在ASCL1啟動子處有一個FLM5腫瘤細胞聚類，但在NEUROD1處沒有。FLM3和FLM5的綜合scATAC分析顯示，99%的FLM5腫瘤細胞重疊于FLM3 ASCL1簇(圖e)，表明這些細胞具有相同的染色質可及性。接下來，研究人員在圖2a中模型系統定義的PCA空間中繪制FLMs通過TF聚類聚合的scATAC-seq，這進一步驗證了原代組織中兩個亞型的染色質狀態(圖f)。總之，這些結果都表明了，人類NEPC轉移的亞型異質性，這些亞型顯示出與模型系統中觀察到的相似的明顯表觀遺傳特征。
在患者轉移中，NEPC亞型是不同的但仍然相關的克隆
(FIG4)
接下來，研究人員試圖使用全外顯子組測序(WES)和拷貝數變異(CNV)從ATAC-seq數據來研究NEC樣本的遺傳特征。從大量ATAC-seq數據推斷RB1基因狀態顯示，在所有NEPC PDX模型中均存在雙等位基因缺失，但在腺癌前列腺癌(ADPC)模型中沒有。通過FLM3和FLM5的tSNE分析，將同樣的方法應用于全基因組的scat-seq簇。結果顯示，這些簇的cnv總體上具有相似性(圖a)。例如，在ASCL1和NEUROD1簇中觀察到所有的chr16和部分chr2和chr13雜合子缺失。此外，我們發現在兩個簇中，在chr10的PTEN上都有一處雜合子缺失。然而，存在明顯的CNV差異，包括chr14p和chr7p擴增20 MB，僅存在于NEUROD1簇。值得注意的是，FLM3中ASCL1成分的CNVs與FLM5中的ASCL1聚類顯示出幾乎相同的特征，而與同一片段內的NEUROD1聚類顯示出較低的相關性(圖b)。雖然FLM樣本來自大塊組織，但WES分析驗證了scacc-seq推斷的CNV改變，包括chr14p和chr7p的擴增。最后，我們將FLM3的CNV分析擴展到單細胞水平。k值意味著基于CNVs的細胞聚類區分了三個簇:一個對應于正常細胞，沒有變化，另外兩個簇顯示變化。另一組細胞在chr7p和chr14p有擴增，與NEUROD1類型相關，第三組細胞沒有與ASCL1類型相關的改變(圖d)。接下來，研究人員在該樣本的scATAC-seq tSNE圖中標記來自遺傳分析中定義的三個集群的細胞的身份，并顯示出與表觀遺傳分析定義的分組的強烈對應(圖e)。重要的是，這種單細胞分析加強了對scATACseq分析中識別的混合聚類的解釋，表明它對應于混合的ASCL1和NEUROD1克隆，而不是一個獨立的克隆。結果顯示，在該患者中存在與兩個NEPC表觀遺傳亞型相關的不同遺傳克隆，考慮到它們的大量CNV譜重疊，可能來自一個共同祖先。
文章小結：
簡單的四張圖，從存在于多種癌癥的神經內分泌腺癌中發現了兩種基因作為標簽的兩種亞群，再根據實驗驗證和單細胞數據分析去進一步研究腫瘤異質性，又使用全外顯子組測序(WES)和拷貝數變異(CNV)從ATAC-seq數據來研究NEC樣本的遺傳特征，為亞型相關研究提供了更多的研究思路。
