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m6A甲基化是最近的熱點，其最大的特點之一就是易于和自己的課題結合。這篇文章的亮點在于我第一次系統地研究了m6A甲基化和鐵死亡的結合，并建立了較完善的研究方法，對大家的研究啟發很大。甚至可以模仿或套用。
m6A和鐵死亡相關的基礎知識
磨刀不誤砍柴工，在進入正題之前一定要先看看m6A和鐵死亡相關的基礎知識。N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常見和最豐富的RNA分子修飾。從發育和代謝到生殖。m6A存在于很多物種質中，占到了RNA堿基甲基化修飾的80%。m6A主要分布在mRNA中，也出現在非編碼RNA如tRNA， rRNA和snRNA。在轉錄成的RNA中相對高的m6A含量會影響RNA的代謝過程，比如剪切，核轉運，翻譯能力和穩定性，以及RNA轉錄。說的這么正式，我總結一下：m6A非常常見，你所研究的疾病或表型很有可能涉及。
下圖帶你全面了解m6A動態過程。
M6A修飾是一個高度動態和可逆的過程，涉及到負責安裝稱為“Writers”的修飾、移除稱為“Erasers”的甲基化和識別稱為“Readers”的修飾的酶(圖1)。每一類調節器的都可以發揮作用，以維持細胞內m6A水平的穩態平衡1。
Writers：在RNA加上甲基，介導RNA的甲基化修飾過程。干這活的是甲基轉移酶，最常見的分子是METTL3和METTL14，兩者可在體外和體內催化mRNA（和其他細胞核RNA）的m6A甲基化。WTAP是這種甲基轉移酶復合體中的另一個關鍵組分。
Erasers：將RNA上甲基去除，介導RNA的去甲基化修飾過程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA（和其他細胞核RNA）上的m6A甲基化。
Readers：識別RNA甲基化修飾的信息，并參與下游RNA的翻譯、降解等過程。比如，YTHDC1可與mRNA上的m6A修飾，促進mRNA出核運輸與可變剪接。YTHDF1/YTHDF3識別m6A后可促進mRNA的翻譯，而YTHDF2與m6A的結合則會促進mRNA的降解。
m6A思路中關鍵技術手段：
M6A-seq和MeRIP-seq測序方法建立于2012年。技術原理是使用特異性抗體富集m6A修飾的RNA片段，將mRNA隨機片段化，進行高通量測序。MeRIP-Seq/m6A-seq 需要構建兩個文庫：MeRIP-Seq/m6A-seq文庫（IP，免疫沉淀）和 RNA-seq文庫（input，對照）。
其中LC-MS/MS和比色法能夠檢測mRNA整體的m6A水平，在這里我自己的實驗用的是比色法，我也更推薦比色法，雖然比色法與LC-MS/MS比較相似，也是從整體水平上檢測RNA上m6A甲基化水平。相對于LC-MS/MS較為繁瑣的操作，比色法更為簡便。研究人員既可以提取totAl RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。還有對應的試劑盒可以使用，其核心原理與ELISA反應類似，經過優化后檢測m6A靈敏度也高。
還有一項必備的驗證試驗用來驗證甲基化相關酶與關鍵基因結合：所謂m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR，即利用m6A抗體在富集到帶甲基化修飾的RNA后，下一步使用qPCR直接對富集到的RNA進行定量的一種技術。這種技術可以做到對發生甲基化的RNA進行相對定量，是一種低成本的檢測方法，僅需m6A抗體，A/G免疫磁珠，磁力架和qPCR儀及配套試劑盒即可開展這類實驗。
鐵死亡
鐵死亡（ferroptosis）是近年發現的一種新型細胞死亡方式，其特征是脂質過氧化物和活性氧(ROS)的過量蓄積。由于該過程依賴鐵，所以被稱為鐵死亡。鐵死亡不僅與眾多疾病的發生發展有關，其相關信號通路上的關鍵蛋白也可成為藥物的作用靶點。鐵死亡的的本質是細胞內脂質氧化物的代謝障礙，進而在鐵離子的催化下異常代謝，產生大量脂質，破壞細胞內氧化還原平衡，攻擊生物大分子，觸發細胞的死亡2。
上圖看起來復雜，但是還是有思路可循，我把其思路進行梳理變化成相關的鐵死亡的特點
根據這些鐵死亡的特點，也就衍生出對應的研究工具出現
形態觀察：透射電鏡直接對細胞形態進行觀察：細胞發生鐵死亡時線粒體變小以及線粒體膜密度較大；
活性氧水平：細胞內活性氧和脂質活性氧通過流式細胞術使用DCFH-DA和C11-BODIPY 熒光探針（購買試劑盒）檢測
細胞活性檢測“”MTT/CCK8檢測細胞活性
鐵水平檢測：可以使用PGSK探針，流式細胞術或共聚焦顯微鏡檢測細胞內鐵含量的細胞膜透性染料；或者使用Iron AssAy Kit（試劑盒）檢測細胞、組織中的鐵水平
線粒體膜電位檢測：通過流式細胞儀收集TMRE陽性細胞的比例
qRT-PCR/Western blot檢測：檢測細胞內與鐵死亡相關的因子的變化，例如COX-2，ACSL4，PTGS2，NOX1，GPX4和FTH1等，其中COX-2，ACSL4，PTGS2和NOX1在鐵死亡細胞中表達上調；GPX4和FTH1在鐵死亡細胞中表達下調。
下面我們進入正題：
這次我主要給大家帶來兩個思路，這兩個思路的特點是簡單好上手換個疾病就是一篇SCI。
這里蛋和雞自然指的就是m6A甲基化和鐵死亡。第一種思路是先發現m6A甲基化再去聯系鐵死亡：m6A甲基化關鍵酶可以誘導鐵死亡
1、m6A甲基化及其關鍵酶改變
首先我們得確定研究的疾病或者表型是否有m6A甲基化及其關鍵酶差異表達。舉個例子：在這里作者3的結果表明，BPQD暴露（處理組）增加了肺細胞中整體RNA m6A的水平，這可能與去甲基酶ALKBH5的下調有關。
2、然后作者將處理組細胞轉錄組和表位轉錄組的變化
這步就是具體研究哪些甲基化相關酶發生變化，有沒有具體的位點。
這些結果表明，RNA m6A表位轉錄組確實受到處理方式對肺細胞的生物學影響。并且這種影響很有可能和眾所周知，脂氧合酶途徑、對硒離子的反應以及脂肪酸代謝過程密切相關。鐵死亡是一種新的調節細胞死亡的形式。它通常是由嚴重的脂質過氧化、谷胱甘肽(GSH)耗竭和鐵超載引起。在死亡細胞中，線粒體的形態發生了很大的變化，包括體積變小，嵴減少，膜濃縮，外膜破壞。在這里，作者通過外轉錄和轉錄分析發現處理方式可能引發肺細胞的鐵死亡。
接下來作者繼續探索機制和下游的影響這是文章深度的關鍵！ALKBH5基因敲除增加m6A并加重處理誘導的鐵死亡。這些結果表明，處理組通過抑制ALKBH5的表達而引發肺細胞鐵死亡。
無獨有偶，在另一篇文章4中作者也發現YTHDC2誘導了LUAD細胞內源性鐵死亡。
在這里作者選用了過表達m6A甲基化關鍵酶閱讀器YTHDC2，作者在這里一定是做了相關的預實驗，才精準的確定了YTHDC2的作用，我個人更傾向于于用生信的方法去篩選，不僅可以提升文章的檔次，還可以增加成功的概率。作者發現YTHDC2在H1299和H1975細胞中不受經典鐵死亡誘導劑和抑制劑如erAstin、RSL3、Fer-1和DFO的影響，表明YTHDC2是一種獨立的內源性體外死亡誘導劑，發揮著經典鐵死亡誘導劑或抑制劑不可替代的作用。
有沒有感覺到很熟悉，相似的思路和套路。不僅如此還可以進階做一些機制實驗。比如：線粒體和抗氧化基因mRNAs的m6A修飾被YTHDF2識別。還可以分別從MeRIPseq和RNA-seq的數據中對差異m6A峰與其相應基因的表達水平進行了關聯分析。根據RNA-seq分析YTHDF2在許多類型的細胞或組織中負責調節mRNA的翻譯、衰變和清除。然后，還可以用RNA免疫沉淀(RIP)qPCR方法檢測了YTHDF2的候選靶向mRNA及其在處理后的變化。
這樣就進一步增加了機制的研究文章的檔次也就上去了。
第一種思路是先通過m6A甲基化來與鐵死亡相關聯，第二種思路5自然是先有鐵死亡再有m6A甲基化。臨床前和臨床藥物(如索拉非尼和Erastin)可以誘導HSC鐵死亡。m6A修飾是否參與HSC鐵死亡的調節？為了測試這種潛在的可能性。
1、作者首先檢測了HSC鐵死亡期間m6A的修飾水平。引人注目的是，m6A rnA甲基化定量分析和斑點印跡顯示，索拉非尼、erastin和RSL3治療后m6A修飾水平顯著增加。接下來就是苦力活了，驗證幾種甲基化的關鍵酶，因為這個時候已經證明了甲基化的變化。在HSC鐵死亡中，METTL4而不是其他甲基轉移酶的蛋白導致mRNA的表達顯著上調，而FTO而不是其他去甲基化酶的水平顯著下調。這些結果表明，HSC鐵死亡時m6A的修飾增加是由于Writers METTL4和Erasers FTO的失調所致。
由于所以利用穩定轉染METTL4 shRNA或FTO質粒的HSC-Lx2細胞，研究上調的m6A修飾是否直接參與了鐵死亡的誘導。經費不足可選擇一個做就可里啦。m6A RNA甲基化定量分析證實，METTL4基因敲除和FTO過表達均可完全減弱Erastin誘導的HSC-Lx2細胞m6A修飾上調此外，METTL4 shRNA或FTO質粒可顯著解除Erastin和索拉非尼對HSC-Lx2和HSC-T6細胞的生長抑制。總體而言，這些數據表明，鐵死亡誘導治療上調m6A修飾可能有助于HSC鐵死亡。說到底就是驗證試驗，當然這步也是必不可少的。
但是這樣還達不到一定的深度，到不了5+。因為機制還差了點，那就是m6A修飾是通過那些途徑引導鐵死亡的？總不能一個一個猜吧。這個時候篩基因當然有請進一步的RNA測序(RNA-seq)，進一步探討m6A修飾促進HSC鐵死亡的分子機制，并確定參與谷氨酰胺代謝途徑、非經典自噬途徑和經典鐵代謝途徑的靶基因。重要的是，KEGG的分析和GO分析充分表明，在HSC鐵死亡過程中，自噬信號可能受到m6A修飾的調節。此外，m6A RNA免疫沉淀(MERIP)qPCR顯示，HSC鐵死亡患者BECN1的m6A修飾水平增加，而ATG3、ATG4A、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG12和ATG16L1的m6A修飾水平無明顯變化。一致地，用FTO質粒或METTL4 shRNA減少m6A修飾后，BECN1的蛋白表達顯著降低，而其他自噬相關基因沒有明顯差異。總之，這些數據表明，m6A修飾誘導的鐵死亡與自噬激活有關。做到這些已經可以輕松駕馭5+了~
全文總結：
以上，大家是否感覺m6A結合鐵死亡這種強強聯合的文章也不是很難呢？這篇文章的亮點在于我第一次系統地研究了m6A甲基化和鐵死亡的結合，并建立了較完善的研究方法，對大家的研究啟發很大。做基礎研究的的基本思路之一就是發現某種現象、表型等，然后分析探討其背后的原因。一件復雜的事物中往往蘊含著簡單規律，無論是學習科研還是做科研也都是有規律可循。今天我借借用幾篇文章一窺普通科研思路套路的升華過程。
正如我開頭所說因為m6A會涉及大多數疾病和表型，所以不用太擔心你研究的內容沒有m6A修飾。并且根據我的檢索這類文章非常少，你還不抓緊時間上車~
參考文獻：
1. Uddin MB, Wang Z, Yang C. The m(6)A RNA methylation regulates oncogenic signaling pathways driving cell malignant transformation and carcinogenesis. Mol Cancer 2021; 20(1): 61.
2. Jiang X, Stockwell BR, Conrad M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol 2021; 22(4): 266-82.
3. Ruan F, Zeng J, Yin H, et al. RNA m6A Modification Alteration by Black Phosphorus Quantum Dots Regulates Cell Ferroptosis: Implications for Nanotoxicological Assessment. Small Methods 2021; 5(3): e2001045.
4. Ma L, Zhang X, Yu K, et al. Targeting SLC3A2 subunit of system XC(-) is essential for m(6)A reader YTHDC2 to be an endogenous ferroptosis inducer in lung adenocarcinoma. Free Radic Biol Med 2021; 168: 25-43.
5. Shen M, Li Y, Wang Y, et al. N(6)-methyladenosine modification regulates ferroptosis through autophagy signaling pathway in hepatic stellate cells. Redox Biol 2021; 47: 102151.
