DNA甲基化新思路，評估CD8⁺TIL和大腸癌的預后

DNA甲基化屬于表觀遺傳學內容，在醫學各個領域（維持正常細胞功能、胚胎發育以及人類腫瘤發生）都能看到他的身影。是近年來新的研究熱點之一，并且熱度一直不下。你是不是也對它垂涎已久？躍躍欲試？但是低分文章千篇一律，毫無新意。高分文章又過于晦澀。其實甲基化的研究其實并沒那么難，快來學習一下吧！

背景知識：

結直腸癌(CRC)是世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因之一。免疫療法在治療可切除和不可切除的結直腸癌方面發揮著越來越重要的作用。免疫檢查點抑制劑可促進T細胞攻擊腫瘤細胞，延長患者生存期。CD8⁺TIL（腫瘤浸潤性淋巴細胞）以細胞毒的方式殺傷腫瘤細胞，并被認為影響大腸癌的預后、免疫治療反應和生存結局。DNA甲基化是組織特異性的，在組織分化中起著決定性的作用。因此，DNA甲基化在不同組織和器官的細胞中是不同的，它有可能成為識別不同細胞的標志物。其中，中等CpG密度區的甲基化是高度保守的，可以區分不同來源的組織類型。此外，在淋巴細胞激活和增殖過程中，部分甲基化區域(PMD)會發生低甲基化，在這些區域中CpG的甲基化可能會將免疫細胞與其他免疫細胞區分開來，這可以通過solo-WCGW來預測。對此，作者開發了一種新的檢測方法，通過利用這些低CpG密度的甲基化來開發生物標記物。

SAH-SYSU：中山大學第六附屬醫院。CCFR：結腸癌家族登記處

文章簡介：

這篇文章發表在期刊: Journal for Immunotherapy of Cancer這篇雜志在最近一年的影響因子為13.751比上一年增加了3.838。在這項研究中，作者的目的是分析免疫細胞和結腸上皮細胞的全基因組DNA甲基化圖譜，以確定CD8⁺T細胞特異的差異甲基化位點(DMP)。然后，我們通過使用這些DMP構建CD8⁺MeTIL簽名評分來評估CD8⁺TIL和大腸癌和其他癌癥的生存結果。

小編解析思路：

結果解讀：

• 結直腸腫瘤中CD8⁺TIL的DNA甲基化特征

為了開發CD8⁺MeTIL特征，作者首先利用EPIC陣列分析的基因組甲基化數據，將CD8⁺T細胞與癌變和正常大腸上皮細胞以及其他人類來源的免疫細胞(包括CD4⁺T細胞、B細胞、粒細胞和單核細胞)的甲基化特征進行了比較。在這一發現步驟中，作者鑒定了73個CD8⁺T細胞特異性的DMP（甲基化位點），它們在CD8⁺T細胞和其他細胞之間高度甲基化(figure 2A)。為了證實發現步驟中的結果，作者分析了這些CD8⁺T細胞特異性DMP的生物學特性。大多數CPGS位于基因內區(80.6%，59個探針)，包括CD8A、CD8B、CD96等CD8⁺T細胞的功能基因，少數為基因間CPGS(19.2%），14個探針。將這些基因作GO分析(figure 2C)。這一發現證實了已鑒定的CpGs與CD8⁺T細胞有很強的相關性。接下來，作者對這73個CpGs的基因組特征進行了分析。CpG多位于低密度區(60.3%，44個探針)和中等密度區(34.2%，25個探針)，少數(5.5%，4個探針)位于高密度區(CpG島) (figure 2B)。作者使用無監督聚類分析，通過評估這三種CpGs，CD8⁺T細胞可以很好地與其他類型的細胞區分開來(figure 2D)。CD8⁺T細胞的CD8⁺MeTIL評分明顯低于癌和正常大腸上皮細胞、CD4⁺T細胞、B細胞、粒細胞和單核細胞(figure 2E)。CD8⁺T細胞中CD8⁺MeTIL評分的高度特異性是其確定腫瘤中CD8⁺T細胞豐度的基礎。此外，作者還用免疫細胞、癌變和正常結腸上皮細胞以及腫瘤微環境中識別的其他細胞類型的DNA甲基化圖譜，在一組獨立樣本中驗證了CD8⁺MeTIL評分的特異性。作者接下來探索CD8⁺MeTIL評分中三個CpGS的甲基化特征與臨床病理特征之間的關系(figure 2F)。作者發現，CD8⁺MeTIL評分較低且甲基化較少的三種CpGS與低頻率的微衛星不穩定性(MSI-H)、右側定位和高分化的大腸癌相關。這些結果與之前基于IHC的CD8⁺TIL相關性研究結果一致。EPIC陣列測定的這三種CpGS的甲基化水平與亞硫酸氫鹽焦磷酸測序測定的甲基化水平顯著相關(figure 3D)。

• 基于qPCR的CD8⁺MeTIL單堿基分辨率分析

為了容易地獲得從基于陣列的分析中產生的CD8⁺MeTIL分數，作者開發了一種基于qPCR的分析方法(QASM)。如figure 3A所示，每個CpG的甲基化和非甲基化等位基因在探針水平上被量化，其中甲基化百分比可以由兩個探針的信號比來確定。為了驗證這種基于qPCR的方法確定CD8⁺MeTIL評分的有效性，作者接下來將QASM分析的結果與SAH-SYSU隊列中的EPIC陣列和pyrosequencing的結果進行了比較(figure 3B)。此外，QASM法測定的甲基化百分率與pyrosequencing測定的甲基化百分率呈線性相關(figure 3C)。因此，QASM法是測定CD8⁺MeTIL評分的一種可靠的技術手段。為了用CD8⁺MeTIL評分測定CD8⁺TIL的分布，作者首先用QASM方法檢測了結直腸癌組織(n=45)及其周圍正常組織(n=44)、正常(NCM460)和癌變(RKO、SW48、HCT8和HCT15)結腸上皮細胞系和代表結直腸癌組織主要成分的多種免疫細胞(CD4⁺T細胞、單核細胞和B細胞)中3種CpGS的甲基化百分率。QASM分析顯示CD8⁺T細胞與其他細胞相比CD8⁺MeTIL評分明顯降低（figure 4A)。并且與EPIC陣列數據集確定的結果一致，進一步支持基于qPCR的CD8⁺MeTIL評分可以作為陣列的評分的準確替代，以確定腫瘤樣本中CD8⁺T細胞的豐度。

• 用CD8⁺MeTIL評分評價CD8⁺TIL在大腸癌中的分布

作者應用這種基于qPCR的CD8⁺MeTIL評分來評估腫瘤組織中的CD8⁺TIL，并將其與SAH-SYSU隊列中IHC染色測定的CD8⁺TIL(CD8⁺PaTIL)進行比較(figure 4B,C)。CD8⁺PATIL與CD8⁺MeTIL評分呈顯著負相關。但是值得注意的是，在免疫組化染色組中，低甲基組的CD8 ⁺ TIL數量比高甲基組的多（figure 4C)。作者檢測了編碼CD8抗原的CD8B基因在SAH-SYSU隊列中的mRNA表達。CD8⁺MeTIL評分與CD8B基因表達特征呈顯著負相關(figure 4D)。接下來，作者根據CCFR隊列中大腸癌患者的分子特征，對QASM法測定的CD8⁺MeTIL評分的分布進行評估。MSI-H組CD8⁺MeTIL評分明顯低于低頻微衛星不穩定(MSI-L)/微衛星穩定(MSS)組（figure 4E)。

• CD8⁺MeTIL在大腸癌和多發性腫瘤中的預后價值

評分在預測大腸癌預后中的作用。在SAH-SYSU和CCFR中，CD8⁺MeTIL評分低的患者與CD8⁺MeTIL評分高的患者相比，OS明顯好于CD8⁺MeTIL評分高的患者(figure 5A和5C中)。接下來，作者探討CD8⁺MeTIL評分是否可以在標記物預測分析中進一步對MSI-H/MSI-L/MSS患者進行分層。在生存分析中，根據SAH-SYSU和CCFR隊列中的MS狀態和CD8⁺MeTIL評分對患者進行分組。正如預期的那樣，死亡風險可以通過CD8⁺MeTIL評分進一步分層(figure 5B,D)。接下來作者利用TCGA中450K甲基化陣列數據對其他癌癥類型進行了生存分析。在24種癌癥類型(肺腺癌(p=0.033)、肺鱗癌(p=0.038)、結直腸癌(p=0.048)、宮頸鱗癌(p=0.044)、乳腺浸潤性癌(p=0.011)和腎上腺皮質癌(p=0.033))中，低cd8⁺metIL評分與較好的生存結果顯著相關。在24種癌癥類型(肺腺癌，p=0.033)中，CD8⁺ MeTIL評分較低與較好的生存結局顯著相關(p=0.048)，宮頸鱗癌(p=0.044)，乳腺浸潤性癌(p=0.011)和腎上腺皮質癌(p=0.033) (figure 5E)。綜上所述，這些數據表明CD8⁺MeTIL評分可以預測多種癌癥的生存結果。

全文總結：

在這項研究中，作者分析了全基因組DNA甲基化圖譜，以確定CD8⁺T細胞特異性DMP，并構建了CD8⁺MeTIL評分來評估結直腸癌中CD8⁺TIL。作者通過顯示CD8⁺MeTIL簽名與基于IHC的CD8⁺PaTIL和CD8⁺ExTIL簽名的緊密關聯，證明了CD8⁺MeTIL簽名在評估基于CD8⁺TIL的免疫應答方面的可靠性。此外，作者開發了一種基于qPCR的QASM方法，可以在單堿基分辨率下有效地確定CD8⁺MeTIL評分，從而能夠以定量的方法評估CD8⁺TIL。最后，作者在兩個大腸癌隊列中驗證了CD8⁺MeTIL對微衛星不穩定性(MSI)/MSS狀態和預后結果分層的能力，并從TCGA腫瘤的泛癌分析中確定了與提高幾種癌癥生存率的相關性。

參考文獻

1. Zou Q, Wang X, Ren D, et al. DNA methylation-based signature of CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes enables evaluation of immune response and prognosis in colorectal cancer. J Immunother Cancer 2021; 9(9).