掃碼聯系客服
胃癌(gastric cancer, GC)包括許多分子亞型，是全球第五大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第三大原因。已經有研究發現胃癌腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)對其發生發展起到至關重要的調控作用，因此小編今天就和大家分享一篇今年8月剛剛發表在Nature Communications（IF:17.694）雜志上刻畫胃癌TME的單細胞分析文章，文章對胃癌微環境中的細胞通訊進行了研究并揭示了不同的T細胞耗竭軌跡，是一篇十分值得參考的使用單細胞數據研究腫瘤微環境的文章。
scRNA-seq of gastric tumor shows complex intercellular interaction with an alternative T cell exhaustion trajectory
胃癌單細胞測序揭示復雜的細胞間相互作用與不同的T細胞耗竭軌跡
一．研究背景
盡管早期胃癌有較高的治愈率，但大多數胃癌患者被發現時已處于晚期或轉移期，他們的預后相對較差。此外，雖然目前針對PD-1和CTLA4的免疫治療已經轉變了許多癌癥的治療模式，但其在胃癌中的應答率仍然相對較低，因此迫切需要對胃癌進行深入研究來開發有效的治療策略。許多先前的研究已經發現腫瘤的異質性和細胞組成的個體差異與生存密切相關，而單細胞RNA測序(scRNA-seq)能夠在更高的分辨率下解析GC的微環境，因此這篇文章作者就應用scRNA-seq來繪制GC的免疫、基質及上皮細胞的轉錄景觀并進行了細致分析，希望能夠貢獻于GC腫瘤微環境和生物學特性的研究以及GC干預措施的開發。
二．文章摘要
研究對10例胃癌患者的腫瘤、癌旁組織及血液樣本的166533個細胞進行分析，發現腫瘤相關基質細胞(TASCs)的Wnt信號和血管生成活性上調，并且與生存呈負相關。研究也發現腫瘤相關巨噬細胞和LAMP3+ 樹突狀細胞（DC）能夠參與介導T細胞活性，并與TASCs細胞相互作用。克隆型和軌跡分析則發現Tc17 細胞(IL-17+ CD8+ T細胞)起源于組織駐留的記憶T細胞，并會分化為耗竭T細胞，這揭示了T細胞耗竭的另一種軌跡。研究也發現IL17+細胞可能通過IL17, IL22和IL26信號通路促進腫瘤進展。
三．主要內容及結果
1. 胃癌微環境的單細胞圖譜
在文章的第一部分作者在單細胞分辨率下對胃癌(GC)的細胞類型多樣性進行了研究。研究納入10例未經治療的原發性GC患者，并使用從腫瘤組織、外周血及癌旁組織中分離出的細胞構建了單細胞測序譜(圖1a)。此外，作者也對樣本組織進行了全外顯子測序(WES)和RNA測序。在整合患者表達譜及質控后，研究最終保留了166533個細胞(圖1b)。接下來，作者將這些細胞劃分為屬于免疫細胞、基質細胞和上皮細胞的12個譜系(圖1b-d)，觀察到幾乎所有細胞類型均在每個患者中都有發現，其中大部分來源于患者GC07、GC08和GC10（圖1e）。研究也獲取了配對的TCR和BCR (T/B細胞受體)測序數據，來研究不同T或B細胞亞型內的狀態轉換。
2. GC中的惡性細胞表現出廣泛的異質性
在文章的第二部分，作者對GC中的惡性細胞進行了分析。作者首先提取上皮細胞并重新聚類，并根據腫瘤和正常組織的特征基因表達情況計算的腫瘤評分(圖2a)，及通過inferCNV計算細胞的拷貝數變異(CNV)得分(圖2b)，以及通過比較腫瘤組織與癌旁組織的WES數據識別的腫瘤特異性突變(圖2c)，同時結合細胞類型特異性基因的表達模式(圖2f)，定義了正常簇、腫瘤細胞簇（圖2d）。接著作者研究了同一例患者組織測序數據是否有相似的基因表達模式，結果發現scRNA-seq和組織RNA-seq數據基因表達高度相關(圖2e)。接下來，作者研究了腫瘤和癌前病變簇的基因表達模式，發現CLDN3、CLDN4和CLDN7在腫瘤細胞和腸化生（IM）細胞中異常高水平表達(圖2f)，且高變異基因平均表達量的相關性分析也表明Tumor_GC07和Tumor GC10簇彼此接近(圖2g)。此外，作者結合(Genotype-Tissue Expression, GTEx)數據也發現其共享一些食管黏膜腫瘤的特異性差異基因（DEGs）(圖2h, i)，且他們在除Tumor_GC08_1外的腫瘤簇中均表達下調(圖2j, k)。
3. 識別驅動腸化生(IM)的潛在調控因子
由于上述識別到了IM簇，因此在這一部分作者對患者的IM進行了分析。作者首先根據細胞類型特異基因計算了單細胞簇及組織中杯狀細胞和腸細胞評分(圖2l, m)，結果發現GC08和GC09腫瘤樣本和癌旁樣本中均有較高水平的IM。接著作者對驅動IM的潛在調控因子進行研究，來尋找與IM的主轉錄因子CDX2表達相關的基因，結果發現CDX2高度相關的基因包括已知的CDX2靶點，如GUCY2C、CDH17、SI和GPA33等(圖2n)。此外，作者還用胃癌細胞系進行過表達實驗，發現HOXA13可以上調CDX2。
4. GC中機制組成經歷了大量重塑
在這一部分，作者對胃癌TME中基質細胞的功能進行了分析。首先重新聚類了所有的基質細胞，結果發現癌旁和腫瘤組織之間有明確分離，這表明TME中的基質細胞與癌旁組織中相比發生了全面的轉錄組學變化(圖3a)。然后，作者將這些基質細胞分為12個不同的簇，發現Endo_1、Fib_1和SMC_1主要富集在腫瘤組織中(圖3b)。作者也發現胃中內皮細胞表達主要組織相容性復合體(MHC)ⅱ類基因，如HLA-DRA和HLA-DRB5(圖3c)，這一點也被胃癌患者腫瘤切片的免疫組織化學(IHC)染色證實(圖3d)。此外，作者也發現Endo_1具有下調的MHCⅱ類基因(圖3f)，進一步對另外9個GC患者樣本進行了流式細胞術也發現腫瘤旁組織中MHC II類內皮的比例高于對照組（圖3g）。同樣，作者進行了IHC染色，來驗證腫瘤中FAP+成纖維細胞和內皮細胞的存在(圖3e)。作者也發現Wnt信號通路中的基因如WNT2和WNT5A在腫瘤成纖維細胞中上調，而抑制Wnt信號通路的SFRP1下調(圖3i)。這些基因在TCGA-STAD數據集中也顯示出相似的表達模式(圖3j)。此外作者也觀察到促進腫瘤生長和血管生成的BMP1和ANGPT2在SMC_1中表達水平顯著升高，免疫組化結果也證實這一點(圖3h)。此后，作者將三種腫瘤富集細胞簇Endo_1、Fib_1和SMC_1中的細胞定義為腫瘤相關基質細胞(TASCs)。作者觀察到，腫瘤進展的關鍵標志血管生成通路在TASCs中顯著上調(圖3k)。然后，作者研究了TCGA-STAD數據集中TASCs的比例和患者生存期之間的潛在關聯，結果發現Fib_1和SMC_1均與較差的預后相關(圖3l)。此外，體外實驗還表明，CAFs來源的上清液對幾種胃癌細胞系具有支持腫瘤生長的能力(圖3m)。綜上所述，作者推測TASCs在胃癌中發生了顯著的重塑并顯示出潛在的促癌特征。
5. 脂質相關巨噬細胞在腫瘤中富集
髓系細胞是高度異質性的免疫細胞群，對TME的形成起重要作用，因此在這一部分作者對髓系細胞進行了進一步分析。作者首先將GC TME中的髓系細胞聚類為8個不同的細胞簇，包括2個單核細胞簇、2個巨噬細胞簇和4個樹突狀細胞(DCs)簇(圖4a, b)，發現巨噬細胞簇Mφ_APOE共表達M1和M2巨噬細胞的特征(圖4c)。通過識別Mφ_APOE和Mφ_THBS1之間的DEGs，作者發現脂質相關基因(APOE, TREM2)和溶酶體基因(GRN, CD63, LAMP1)在Mφ_APOE中高表達，并且在腫瘤中特異性升高(圖4d, e)，表明脂質相關和溶酶體功能是GC中巨噬細胞的關鍵標識(圖4c)。作者也發現MITF, NR1H3和TFEC在Mφ_APOE中特異性上調，并且這些調控因子也表現出與脂質相關基因和溶酶體基因表達相似的模式(圖4f)。此外，作者發現與對照組相比TFEC及NR1H3過表達顯著上調了巨噬細胞中APOE和APOC1的表達(圖4g)。除了cDC1_XCR1、cDC2_CD1C和pDC_LILRA4三種傳統的DC細胞類型，作者還識別了一種非經典的DC細胞類型DC_LAMP3，其特征是LAMP3和CCR7的特異性表達(圖4b)。作者基于RNA速率分析認為LAMP3+DC可能來源于cDC2(圖4h)，且作者也發現雖然cDC2_CD1C細胞LAMP3和CCR7表達水平極低，但LAMP3和CCR7的未剪切RNA相對較高(圖4I)。
6. 大多數胃腫瘤的TME中都存在Tc17細胞
在這一部分作者對GC中T細胞的多樣性進行了分析，首先提取了具有scRNA-seq數據和配對TCR信息的T細胞，并將其重新聚類為10個CD8+簇、6個CD4+簇、3個CD4+ Treg簇和1個代表T細胞當前在細胞周期中進展的循環簇(圖5a-c)。作者觀察到10例患者中，有8例CD8+ IL17+ T細胞占腫瘤浸潤T細胞總數的1%以上，且多色IHC染色也證實了胃癌TME中CD8+ IL17+ T細胞的存在(圖5d)。作者通過富集分析也發現CD8_C8_IL17A中上調的基因顯著富集于Th17細胞分化和炎癥性腸病(IBD)通路(圖5e)，這表明CD8_C8_IL17A和Th17細胞在胃癌TME中可能存在功能重疊。由于CD8_C8_IL17A細胞的這些特征與Tc17細胞相似，因此作者將這一簇細胞命名為Tc17。此外，作者也觀察到T細胞簇顯示出不同的組織分布模式(圖5b)。
7. Tc17和Th17細胞可能通過IL17/22/26信號通路促進胃癌的生長
這一部分作者試圖通過體外實驗了解Tc17細胞在胃癌中的功能，結果發現從胃癌中分離的Tc17細胞可刺激腫瘤細胞產生CXCL12，進而招募髓源性抑制細胞(MDSCs)，從而抑制細胞毒性CD8+ T細胞。此外，作者也發現多個Tc17細胞顯著上調基因能夠促進腫瘤進展，它們的受體也在腫瘤細胞中上調(圖5g)，且TCGA-STAD數據中也發現這些受體在腫瘤組織中高表達(圖5h)。因此，作者假設在胃癌中IL17+ T細胞可以通過IL17, IL22和IL26信號通路促進腫瘤生長。
8. 用TCR分析解析T細胞亞型的狀態轉變
在這一部分作者試圖通過TCR克隆信息和偽時序分析來解析不同亞型T細胞之間的細胞狀態轉換。作者觀察到T細胞中識別的36239個克隆型中，有30980個克隆型僅檢出1次(唯一TCR)， 5259個克隆型檢出2個或2個以上(非唯一TCR)，個體克隆群體大小從1到569(圖6a)。作者也觀察到除na?ve CD8+ T細胞(CD8_C1)外，CD8+ T細胞簇的克隆擴張程度均高于CD4+ T細胞簇(圖6b)。研究也發現CD8_C2(效應細胞)、CD8_C3(細胞毒性)、CD8_C4(效應細胞記憶)和CD8_C10 (MAIT)簇的克隆細胞比例較高(圖6c)，且在高克隆簇中，CD8_C2多來源于血液，其標記基因富集在細胞遷移相關通路中(圖6d)，因此作者推測CD8_C2具有從血液滲入組織的潛力。作者也發現相同克隆型的T細胞更有可能聚集在同一簇或密切相關的簇中(圖6e、f)。通過單細胞TCR測序數據作者根據每個T細胞簇內的TCR基因使用情況將T細胞簇嵌入到一個3D空間(圖6g)，嵌入空間也表明CD8+ T細胞比CD4+T細胞顯示出更大的異質性。接下來作者根據配對細胞簇共享的TCR克隆型的比例計算了克隆型共享矩陣，來評估它們譜系中的關系(圖6h)，結果觀察到與CD8+ T細胞相比，CD4+ T細胞的克隆型共享矩陣稀疏，因為CD4+ T細胞的克隆擴增要低得多(圖6b)。作者根據克隆型共享矩陣(圖6h)以及血液和組織之間的共享比例(圖6c)的差異，假設了T細胞狀態轉換的兩種可能軌跡(圖6i)：一個軌跡為來源于CD8_C2(效應細胞)的CD8_C3(細胞毒性)細胞轉變為CD8_C4(效應記憶)或CD8_C9(耗竭)細胞；另一個軌跡為來源于CD8_C5 (駐留)的CD8_C8 (Tc17)細胞轉化為CD8_C9(耗竭)細胞。
9. 駐留CD8+ 通過Tc17參與T細胞耗竭軌跡
在這一部分作者對這些簇間的分化軌跡進行了進一步分析，首先在每個軌跡的簇中提取了共享相同克隆型的細胞，然后使用RNA速率分析來研究擴散圖的方向性(圖6j, k)，結果發現了一個來源血液的CD8+ T細胞通過CD8_C3(細胞毒性)細胞流向耗竭簇的強定向流(圖6j)。沿著這條耗竭軌跡，T細胞的殺傷分數逐漸降低，耗竭分數逐漸升高(圖6l, m)。且RNA速率顯示，組織駐留的CD8+ T細胞也通過Tc17細胞向耗竭群體定向流動(圖6j)，表明組織駐留的CD8+ T細胞在TME中分化為Tc17細胞，進而產生耗竭表型。因此，作者將T細胞耗竭的兩種軌跡命名為"細胞溶解耗竭軌跡"和" Tc17耗竭軌跡"。盡管最終都達到了耗竭狀態，但作者發現Tc17耗竭軌跡的耗竭評分與細胞溶解耗竭軌跡相比顯著升高(圖6)。此外，盡管經歷了廣泛的克隆擴增，Tc17在非na?ve CD8+ T細胞中的細胞溶解評分最低(圖6b)。總體而言，細胞溶解評分沿著細胞溶解耗竭軌跡降低，而沿著Tc17耗竭軌跡增加(圖6)。
10. 不同的轉錄程序與兩種耗竭軌跡相關
在這一部分，作者對上述這兩種耗竭軌跡相關的轉錄程序進行了研究。作者推測Tc17細胞和細胞毒性T細胞可以產生兩種不同類型的具有不同轉錄程序的耗竭T細胞，且差異基因分析也表明，Tc17來源的耗竭T細胞高表達KRT86，而細胞溶解來源的耗竭T細胞高表達GZMK(圖7a、b)。為了研究驅動這兩個軌跡不同轉錄程序的潛在機制(圖7c)，作者重點分析了在這兩條軌跡中差異表達和激活的轉錄因子(TFs)的動態變化，使用SCENIC識別沿兩種軌跡有差異激活的TF(圖7d)。通過SCENIC，結合偽時序和基因表達分析，作者發現與Tc17耗竭軌跡相比，EOMES及其下游靶點的表達在細胞溶解耗竭軌跡中均較高(圖7c-f)。同樣，由于這些因子及其下游靶點的高表達，RUNX2被確定為Tc17耗竭軌跡中的潛在關鍵調節因子(圖7c-f)。綜上所述，作者識別了兩個衰竭過程中不同的調控程序，并確定了兩個過程的潛在關鍵調控因子。
11. 腫瘤相關的基質細胞和髓細胞是復雜的細胞相互作用的關鍵介質
在這一部分作者對參與胃癌的各種細胞類型之間復雜的通訊網絡進行了分析。作者通過CellPhoneDB識別了腫瘤和正常組織中的細胞相互作用，發現涉及TASCs和巨噬細胞的相互作用主導了TME網絡。作者觀察到Fib_1表達了大量腫瘤細胞的生長因子，Endo_1強激活TNF、VEGF、PDGF、PGF和Notch信號通路(圖8a, b)。通過進行各細胞類型之間的相關性分析，作者也發現研究數據集和TCGA-STAD隊列中，TASC亞型的比例都是高度正相關的(圖8c)。此外，作者通過體外共培養實驗發現CAFs分泌的某些細胞因子可以誘導THP-1單核細胞來源的巨噬細胞進入GC TME中的巨噬細胞狀態，上調Mφ_APOE和Mφ_THBS1標記基因(圖8 d)，且Mφ_APOE評分呈持續上升趨勢，而Mφ_THBS1評分在誘導過程中呈現輕微變化(圖8e)。接下來，作者研究了TME中與淋巴細胞相關的顯著相互作用(圖8f)，并通過多色IHC染色證實了胃癌患者腫瘤切片上NECTIN2-TIGIT相互作用的存在(圖8f)。
到這里，這篇文章的主要內容就結束了。文章構建了一個全面的胃癌單細胞轉錄組圖譜，刻畫了免疫亞群，基質亞群和上皮亞群的詳細和復雜的分類，并進一步闡明了它們的分子特征和細胞間通訊，并識別出不同的T細胞耗竭軌跡。文章內容豐富，邏輯嚴謹，對每個結果都從多個角度進行了分析驗證，無論是方法還是內容都值得小伙伴們參考學習。
