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不知道大家是否還記得去年7月底生信人給大家推送的腫瘤乳酸熱點專題，主要對乳酸在腫瘤進程中的重要作用進行總結，還分享了TME相關乳酸代謝純生信新思路。去年我們還在感慨6月推出的焦亡思路，10月份一檢索就已經三篇文章了，還好乳酸思路尚有機會。好巧不巧，今年的乳酸思路又又又又成真了。一篇Cancer Cell（IF: 2020，31.7436; 2021預測，34.949），一篇Frontiers in Oncology（IF: 2020，6.2437; 2021預測，5.452）再一次敲響腫瘤乳酸代謝的大門。這里小編就不得不凡爾賽一下了，我們對腫瘤研究熱點的把握就是這么迅速，敏捷，精準，吼吼！畢竟腫瘤代謝和腫瘤免疫那么火，發文那么快，影響因子那么高也是情理之中啦。今天小編想和大家分享的第一篇就是關于乳酸與腫瘤免疫相關的分析文章，Cancer Cell出品，質量有保證哦。
Lactic acid promotes PD-1 expression in regulatory T cells in highly glycolytic tumor microenvironments
乳酸在高糖酵解性腫瘤微環境中促進調節性T細胞PD-1的表達
在腫瘤微環境(TME)中，表達PD-1的CD8+ T細胞和調節T細胞之間的平衡決定PD-1阻斷治療的臨床療效。然而，決定這種平衡的因素仍然是未知的。在myc擴增腫瘤和肝臟腫瘤等高糖酵解性腫瘤中，與效應T細胞相比，PD-1在Treg細胞表達更高。在低糖環境下，Treg細胞通過腫瘤細胞消耗葡萄糖，通過單羧酸轉運體1 (moncarboxylate transporter 1, MCT1)主動吸收乳酸(LA)，促進NFAT1轉位入核，從而增強PD-1的表達，而效應T細胞的PD-1表達被抑制。PD-1阻斷激活表達PD-1的Treg細胞，導致治療失敗。因此，研究者認為LA在高糖酵解TME中通過上調PD-1的表達，是TME中Treg細胞功能的活躍檢查點。
圖片摘要.乳酸在高糖酵解性腫瘤微環境中促進調節性T細胞PD-1的表達
1.腫瘤的糖酵解活性與TME中eTreg（效應Treg）細胞表達PD-1相關
研究者首先對TME中影響Treg細胞表達PD-1的因素進行探究。Treg細胞通常與主轉錄因子FOXP3的表達有關。因此，研究者根據naive T細胞標記物CD45RA和FOXP3的表達水平對人類Treg細胞進行分類:naive Treg細胞(CD45RA+ CD25low FOXP3low CD4+) (I)；eTreg細胞(CD45RA- CD25high FOXP3high CD4+) (II);和非Treg細胞(CD45RA- CD25low FOXP3low CD4+) (III)。研究者基于手術切除胃癌(GC)和非小細胞肺癌(NSCLC)的表達譜數據（GSE190139，GSE190141，GSE152040），對PD-1高表達的eTreg細胞(PD-1高表達的eTreg細胞)與PD-1低表達的eTreg細胞(PD-1低表達的eTreg細胞)腫瘤特點進行探究(圖1A)。基因集富集分析(GSEA)發現，在PD-1高表達eTreg細胞的GC和NSCLC腫瘤組織中，糖酵解相關基因集和myc靶向基因集顯著富集(圖1B)。與PD-1含量低的eTreg細胞相比，PD-1含量高的eTreg細胞中LDHA和MYC的基因表達更高(圖1C)。MYC是糖酵解的重要調節因子。研究者進一步對腫瘤表達MYC的免疫效應進行探究，發現腫瘤浸潤性CD8+ T細胞與eTreg細胞的比值以及腫瘤浸潤性CD8+ T細胞的PD-1表達在myc過表達(MYC high)的GCs和nsclc中顯著低于MYC low腫瘤(圖1D和1E)。相比之下，腫瘤浸潤的eTreg細胞在MYC high GCs和NSCLC中的PD-1表達顯著高于MYC low的 GCs和NSCLC(圖1E)。
因此，研究者推測eTreg細胞在高糖酵解腫瘤中PD-1的表達可能上調。對來自NSCLC原發病灶和肝轉移病灶的成對標本進行免疫組化(IHC)分析，研究者發現與原發病灶相比，肝轉移病灶中糖酵解相關蛋白，包括LDHA、PDK1和HIF1a的表達顯著升高(圖1F)。肝轉移灶中FOXP3+ CD4+ T細胞的PD-1表達也明顯高于原發灶，而CD8+ T細胞的PD-1表達降低(圖1G和1H)。
圖1.eTreg表達的PD-1在高糖酵解性腫瘤中升高
2.LA通過MCT1增強eTreg細胞的PD-1表達，但不增強CD8+ T細胞的PD-1表達
研究者繼續對eTreg細胞在糖酵解性腫瘤中比CD8+ T細胞表達更高PD-1的機制進行探究。從手術切除的NSCLC標本中制備4個腫瘤浸潤T細胞亞群，PD-1+或PD-1-的CD8+ T細胞和PD-1+或PD-1-的eTreg細胞。對四個T細胞亞群的基因表達進行富集分析，以確定那些在eTreg細胞中與PD-1表達正相關，而在CD8+ T細胞中沒有的基因(圖2B)。在PD-1+ eTreg細胞穩健表達的富集基因中，研究者注意到一個LA轉運蛋白，編碼MCT1的Slc16a1(圖2C)。鑒于LA是腫瘤糖酵解的最終產物，研究者探究是否可以通過MCT1吸收LA，從而誘導eTreg細胞表達PD-1。事實上，PD- 1高 eTreg的晚期GC中LA含量明顯高于PD- 1低eTreg細胞(圖2D)。進一步采用流式細胞術檢測各組T細胞亞群中MCT1蛋白的表達。與LA代謝相關的MCT1和LDHB在PD-1+ eTreg細胞中表達顯著升高，而在PD-1+ CD8+ T細胞中表達明顯降低(圖2E和2F)。MCT1的細胞表面表達是通過與CD147的緊密相互作用而促進的。與eTreg細胞一致，CD147是由激活的人類Treg細胞特異性表達的。對來源于人類高級GC樣本和小鼠腫瘤模型的腫瘤浸潤淋巴細胞流式細胞術分析表明，eTreg細胞中MCT1、CD147和LDHB蛋白表達顯著升高(圖2G, 2H)。
公共數據集中的染色質免疫沉淀測序(ChIP-seq)數據表面SLC16A1和BSG(編碼CD147)基因都含有FOXP3結合位點。在FOXP3過表達的細胞中，MCT1和CD147的表達明顯高于對照組細胞，提示FOXP3可直接促進eTreg細胞MCT1和CD147的表達。
研究者進一步對每個T細胞亞群中LA和PD-1表達之間的直接聯系進行探究。在低糖條件下，用抗CD3和CD28單克隆抗體(mAbs)刺激CD8+ T細胞和eTreg細胞。隨著LA濃度的增加，eTreg細胞的PD-1表達顯著升高。相比之下，CD8+ T細胞中PD-1的表達與LA濃度成比例下降(圖2I和2J)。當Treg細胞通過MCT1從微環境中攝取LA時，LA在Treg細胞中被代謝為磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP被稱為代謝免疫檢查點，可以激活T細胞功能。PEP增加細胞質中的鈣離子(Ca2+)濃度，促進NFAT1易位入核。從本工作的數據來看，LA濃度的增加導致Treg細胞中PEP含量、Ca2+含量和核內NFAT1表達顯著升高，而在CD8+ T細胞中，在低糖條件下刺激T細胞時，則沒有升高(圖2K、2L)。進一步評估LA濃度對低糖環境下CD8+ T細胞和Treg細胞增殖和凋亡的影響。與CD8+ T細胞相比，eTreg細胞在低糖條件下因LA增加而增殖旺盛，凋亡較少。此外，在低LA或高LA環境下進行T細胞抑制試驗，研究者發現eTreg細胞在高LA(低葡萄糖)濃度下變得更受抑制(圖3A)。
圖2.LA通過MCT1誘導eTreg細胞表達PD-1
接著，研究者進一步探究在高LA條件下MCT1表達與Treg細胞抑制活性之間的相關性。在低葡萄糖和高LA條件下，Slc16a1在Treg細胞中的遺傳消融降低抑制活性，但在低LA(正常葡萄糖)條件下卻沒有(圖3B和3C)。綜上所述，在低糖高LA環境下，eTreg細胞通過MCT1(由FOXP3控制)攝取LA，從而上調PD-1的表達，而在CD8+ T細胞中則呈相反趨勢。
3.PD-1阻斷增強高LA環境下eTreg細胞的免疫抑制活性
研究者進一步探究PD-1阻斷是否可以增強低糖高LA條件下eTreg細胞的抑制功能。更高濃度的LA通過PD-1阻斷逐漸降低CD8+ T細胞IFN-g的生成；使用更高濃度LA的抗PD-1單抗增強eTreg細胞的抑制活性。
在低LA或高LA條件下進行抑制實驗。在低LA環境中，通過添加抗PD-1單克隆抗體可以增加Tresp細胞的增殖，而在高LA環境中則不能(圖3E和3F)。當Tresp細胞與eTreg細胞在低LA環境下共培養時，Tresp細胞優先被抗PD-1單克隆抗體激活，與eTreg細胞的抑制情況類似(圖3E)。相比之下，在高LA環境下，Tresp細胞與eTreg細胞共培養時，eTreg細胞的抑制活性增強，PD-1阻斷使Tresp細胞增殖嚴重受損，提示PD-1+ eTreg細胞優先激活(圖3F)。因此,PD-1封鎖可以增強eTreg細胞在低糖高乳酸環境下的活性,導致CD8 + T細胞功能被抑制,表明高la誘導的PD-1高eTreg細胞與PD-1阻斷治療失敗之間的直接聯系。
圖3.Treg細胞的MCT1表達對于維持高LA環境下的抑制活性至關重要
4.MYC表達通過調節糖酵解活性和創造高LA TME來調節PD-1表達的平衡
MYC high腫瘤的臨床樣本數據(圖1D和1E)促使研究者使用動物模型評估腫瘤MYC表達對TME中T細胞PD-1表達的影響。研究者建立MYC過表達的MC-38(小鼠結腸癌細胞株)和B16-OVA(小鼠黑色素瘤細胞株)(圖4A)。糖酵解的關鍵調控因子己糖激酶2和LDHA在MYC過表達細胞株中的表達高于模擬細胞株(圖4A和4B)。因此，與模擬細胞株相比，MYC過表達細胞株在體外和體內產生的LA數量顯著增加(圖4C和4D)。MYC過表達的MC-38腫瘤在免疫缺陷和免疫能力低下的小鼠中都比對照腫瘤生長得更快(圖4G)。因此，MYC過表達的MC-38腫瘤中CD8+ T細胞的數量(計數/腫瘤重量)明顯低于對照組(圖4E)。在MYC過表達的MC-38腫瘤中，與對照腫瘤相比，Treg細胞的PD-1表達顯著升高。盡管在MYC過表達的MC-38腫瘤中，CD8+ T細胞的PD-1表達顯著低于對照組(圖4F)。抗PD -1單克隆抗體的抗腫瘤作用在MYC過表達的MC-38腫瘤中顯著減弱(圖4G)。在B16-OVA模型中也觀察到類似的結果(圖4E、4F和4H)。
在MYC過表達的MC-38腫瘤中，抗PD -1單抗處理顯著增強激活標記物(CTLA-4、ICOS和GITR)的表達和Treg細胞的增殖。而在對照腫瘤中，抗PD-1單抗處理后未觀察到Treg細胞的功能和增殖增強(圖4I, 4J)。抗原提呈細胞(APCs)是Treg細胞的重要靶點，在MYC過表達腫瘤中，抗PD-1單抗治療抑制TME中APCs的成熟。在MYC過表達腫瘤中，抗PD-1單克隆抗體并沒有增加TME中MuLV-15E四聚體+ CD8+ T細胞和TNF-a+ IFN-g+ CD8+ T細胞的頻率(圖4K和4L)。因此，MYC過表達腫瘤TME，尤其是Treg細胞中豐富的LA增加PD-1的表達，從而導致PD-1被阻斷后Treg細胞抑制活性增強而引起的治療耐藥性。
圖4.腫瘤細胞表達MYC可促進糖酵解并導致對PD-1封鎖的抵抗
5.肝內腫瘤在TME中增強糖酵解，促進Treg細胞PD-1的表達
臨床樣本數據(圖1G和1H)表明，在肝轉移瘤中eTreg細胞誘導PD-1表達。將MC-38或B16-OVA細胞接種于C57BL/6小鼠皮下或直接接種于肺或肝臟中。免疫印跡檢測顯示肝內腫瘤通過HIF1a高表達PDK1和LDHA(圖5A和5B)。肝內腫瘤組織間質液中LA濃度顯著升高(圖5C)。與MYC過表達腫瘤相似，肝內腫瘤中CD8+ T細胞的數量和PD-1表達明顯減少，而Treg細胞的PD-1表達明顯增強(圖5D和5E)。抗PD -1單抗治療對肝內腫瘤沒有抗腫瘤作用(圖5F和5G)，而是激活肝內腫瘤中的Treg細胞(圖5H、5I)，并抑制APCs的成熟。因此，在肝內腫瘤中，抗PD -1單克隆抗體并不能增強腫瘤響應和/活化的CD8+ T細胞(圖5J和5K)。總之，肝內TME中豐富的LA誘導Treg細胞表達PD-1，導致抗PD-1單抗治療的耐藥。
圖5.肝內腫瘤誘導缺氧微環境，抑制PD-1阻斷效果
6.通過抑制Treg細胞LA代謝，可以克服MYC過表達腫瘤對PD-1阻斷的耐藥
研究者進一步探究靶向腫瘤細胞的LDHA或TME中Treg細胞的MCT1是否可以恢復MYC過表達腫瘤中抗PD -1單克隆抗體的療效。研究者發現不論是在過表達MYC細胞中敲除LDHA，還是使用藥物(GSK2837808A LDHi)抑制LDHA，都可以減少LDHA的產生，逆轉CD8+ T細胞和Treg細胞中PD-1的表達平衡，抑制Treg細胞的抑制功能，使抗PD-1單克隆抗體的療效顯著提高（(圖6A- 6H）。因此，可以通過靶向腫瘤中的LDHA或Treg細胞的MCT1來克服MYC過表達腫瘤對PD-1阻斷的耐藥性。
圖6.通過抑制Treg細胞LA代謝，可以克服MYC過表達腫瘤對PD-1阻斷的耐藥性
7.通過靶向Treg細胞LA代謝恢復在肝內腫瘤中的抗PD-1阻斷作用
研究者進一步測試TME中靶向腫瘤細胞的LDHA或Treg細胞的MCT1是否可以增強抗PD -1單克隆抗體在肝內腫瘤中的療效。與MYC過表達腫瘤相似，LDHA的遺傳和藥理抑制均能減少肝內腫瘤中LA的含量，逆轉T細胞的PD-1表達平衡，抑制Treg細胞的抑制功能，從而提高了抗PD-1單克隆抗體的療效(圖7A- H)。此外，對Treg細胞MCT1的遺傳和藥理抑制降低PD-1表達，增加肝內TME中活化的CD8+ T細胞，從而顯著增強抗PD-1單克隆抗體的抗腫瘤療效(圖7I-P)。因此，抗PD -1單克隆抗體的抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤中的LDHA或肝內腫瘤中Treg細胞的MCT1而恢復的。
圖7.靶向Treg細胞的LA代謝恢復在肝內腫瘤中的抗PD-1阻斷作用
8.基于糖酵解相關分子表達預測PD-1阻斷的有效性
在接受PD-1阻斷的胃癌、非小細胞肺癌和惡性黑色素瘤患者中，LDHA或MYC高表達的患者表現出較短的無進展生存期(PFS)(圖8A、8B)。與無MYC擴增的胃癌患者相比，有MYC擴增的胃癌患者PFS顯著縮短(圖8C)。有肝轉移的胃癌和NSCLC患者接受PD-1阻斷治療后，PFS顯著低于無肝轉移的患者(圖8D)。總之，MYC擴增和肝轉移以及免疫阻斷的耐藥性有關。
圖8.糖酵解相關分子與PD-1阻斷的有效性
這篇文章的主要內容就是這些，研究者主要對乳酸在高糖酵解性腫瘤微環境中促進調節性T細胞PD-1的表達進行機制分析，發現高糖酵解性腫瘤消耗葡萄糖，釋放過量的LA，增加PD-1的表達，抑制Treg細胞的活性，從而導致部分PD-1阻斷治療無效，通過靶向Treg細胞LA代謝可以恢復在肝內腫瘤中的抗PD-1阻斷作用，充分說明乳酸與免疫治療間存在的緊密關聯。
相比于第一篇文章而言，第二篇就簡單多啦，是一篇純生信的代謝分析文章。我們在這里就只做簡單介紹，感興趣的小伙伴們就自行學習啦。皮膚黑色素瘤(SKCM)是一種以高度免疫細胞浸潤為特征的皮膚癌類型。乳酸是SKCM腫瘤微環境(TME)的主要代謝產物，但其潛在功能尚不清楚。在這篇文章中，研究者對TCGA數據庫中SKCM患者的乳酸相關基因對預后和免疫檢查點抑制劑(ICIs)響應的預測價值進行探究。首先，研究者基于TCGA和GTEX數據識別出在正常皮膚和SKCM樣本中發生差異表達的乳酸相關基因，并基于單因素cox分析篩選出與預后相關的差異表達乳酸相關基因。進而基于多因素cox分析和LASSO cox分析構建預后特征，比較不同預后風險患者在預后，臨床特征，生物學功能，腫瘤微環境和免疫響應等方面的差異，并在獨立數據集合中進行驗證。
圖9.流程圖
1.基于TCGA和GTEX數據識別出在正常皮膚和SKCM樣本中發生差異表達的乳酸相關基因，對乳酸相關差異表達基因進行GO和KEGG功能富集分析，并構建乳酸相關差異表達基因的蛋白質互作網絡。
圖10. 差異表達乳酸相關基因的識別及其功能富集分析
2.通過無監督一致聚類方法，基于差異表達的乳酸相關基因，將SKCM樣本分為不同的聚類(K = 2 ~ 9)，并根據共識矩陣、共識CDF曲線和CDF曲線下面積的相對變化，進行最優劃分。不同類別患者的預后生存時間以及潰瘍狀態等臨床特征存在差異。
圖11.基于差異表達乳酸相關基因的一致性聚類
3.首先基于單因素cox分析篩選出與預后相關的差異表達乳酸相關基因，進而基于多因素cox分析和LASSO cox分析構建預后特征，預后特征基因表達與患者預后有關。
圖12.基于TCGA數據構建構建乳酸相關基因的預后特征
基于預后特征風險打分將患者進行劃分，與低風險打分患者相比，高風險組患者的預后更差。NARS2等特征基因在在兩套數據的相同類型患者中，表達趨勢一致。
圖13. 乳酸相關基因預后特征的預后價值
4.不同風險組患者展現出不同的預后特征，并且可以作為SKCM患者的獨立預后因素，具有比較強的臨床實用性。
圖14. 乳酸相關基因預后特征的臨床實用性
5. 構建臨床列線圖。
圖15.臨床列線圖的構建與評估
6. 識別不同風險組患者的差異表達基因，并對其進行富集分析，以識別預后特征相關的生物學過程和通路。
圖16.差異表達基因的功能富集分析
7.乳酸風險打分與六種免疫細胞浸潤豐度的相關性。
圖17. 風險打分與六種免疫細胞浸潤豐度的相關性
8.乳酸風險評分與腫瘤微環境相關，不同風險評分患者展現出不同的腫瘤微環境。
圖18. 乳酸風險評分與腫瘤微環境相關
9. 乳酸風險評分與腫瘤免疫治療響應相關，不同風險評分患者對腫瘤免疫治療響應不同。
圖19.乳酸風險評分與腫瘤免疫治療響應相關
細心的友友們一定能發現，不管是之前的m6A，細胞焦亡，還是現在的乳酸代謝等等等，很多思路的研究方法都一致，會很疑惑創新性在哪，甚至會認為這是種重復，沒啥意義。但咋說呢，現階段研究預后的手段就那么幾種，文章的靈魂不僅在于研究方法，更在于研究疾病和研究內容的緊密關聯。研究方法創新性不強，那我們完全可以在研究內容上殺出重圍，闖出自己的一片天空啊。不知道如何把握研究內容，掌握研究熱點的小伙伴也不要擔心，趕快跟上我們的步伐，大家一起殺出重圍吧。
參考文獻：
1.Lactic acid promotes PD-1 expression in regulatory T cells in highly glycolytic tumor microenvironments
2.Identification of Lactate-Related Gene Signature for Prediction of Progression and Immunotherapeutic Response in Skin Cutaneous Melanoma
