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在生信分析中，算法的開發(fā)和創(chuàng)新是一個非常重要的環(huán)節(jié)。隨著單細(xì)胞技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)有的一些分析算法存在的不足已經(jīng)日漸暴露出來了。就在近日，nature communications（14.913）上新發(fā)表了一篇關(guān)于單細(xì)胞數(shù)據(jù)聚類的新算法，就讓我們一起來看看這個新的算法具體又是怎樣創(chuàng)新的吧。
DUBStepR——一種用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)準(zhǔn)確聚類的可擴(kuò)展的基于相關(guān)性的特征選擇方法
摘要
特征選擇，也就是標(biāo)記基因的選擇，被廣泛認(rèn)為是提高聚類準(zhǔn)確度的關(guān)鍵步驟。而目前現(xiàn)有的方法都未考慮到基因相關(guān)性的影響，因此本文提出了一種利用基因之間的相關(guān)性的新的特征選擇算法——DUBStepR（Determining the Underlying Basis using Stepwise Regression）。它不但可以鑒定出類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC中與疾病相關(guān)的常見和罕見的細(xì)胞類型，也可以應(yīng)用于大型的數(shù)據(jù)集中，并且還可能可以直接應(yīng)用于其他單細(xì)胞數(shù)據(jù)類型中，如scATAC-seq。
背景介紹
scRNA-seq數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類過程通常包括質(zhì)控、標(biāo)準(zhǔn)化、特征選擇、主成分分析（PCA）、基于距離聚類以及細(xì)胞類型定義。盡管在這個過程中特征選擇是一個很關(guān)鍵的步驟，但是目前而言，對于scRNA-seq中的特征選擇的方法研究還很少。其中一個比較好的特征選擇算法就是選擇細(xì)胞類型特異性（DE）基因作為特征，但這種算法還需要優(yōu)化不同細(xì)胞類群之間在生物學(xué)上的不同特征的區(qū)分。目前使用最多的特征選擇方法是均值方差建模（mean-variance modeling）。本文中提到了M3Drop和GiniClust兩種方法，但它們都未將基因表達(dá)之間的相關(guān)性考慮進(jìn)去。
基于以上，研究人員提出了DUBStepR這種基于基因之間相關(guān)性的特征選擇算法，具體流程見圖1中。同時，為了評估這種新的算法的適用性和性能，研究人員納入了四種不同類型的數(shù)據(jù)同時與其他7種常用的特征選擇算法進(jìn)行了比較。最后還將此算法應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者PBMC中的單細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)上。
PBMC，也就是外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood monoculear cell)，起源于位于骨髓(bone marrow)的造血干細(xì)胞( hematopoietic stem cells, HSCs)，主要包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞，B細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞)和單核細(xì)胞。通常情況下，淋巴細(xì)胞約占70 – 90%，單核細(xì)胞約占10 – 30%，不同個體之間這些細(xì)胞群的比例可能存在差異。
圖1 DUBStepR流程圖
結(jié)果
1. 利用基因之間的相關(guān)性預(yù)測細(xì)胞類型特異性DE基因
DUBStepR的第一步是根據(jù)細(xì)胞類型特異性DE基因（標(biāo)記基因）的已知特征選擇一組初始候選特征。相同細(xì)胞類型的特異性DE基因往往是高度正相關(guān)，而不同細(xì)胞類型的特異性DE基因可能是負(fù)相關(guān)的（圖2a，b）。相比之下，非DE基因之間可能只是弱相關(guān)性（圖2c）。因此研究人員假設(shè)，由基因最強正相關(guān)系數(shù)和最強負(fù)相關(guān)系數(shù)之間的差異得出的相關(guān)范圍分?jǐn)?shù)在DE基因中會顯著升高。事實上，DE基因的相關(guān)范圍得分確實顯著高于非DE基因（圖2d）。
圖2 DE基因的表達(dá)相關(guān)性
2. 逐步回歸法（Stepwise regression）識別最小冗余特征子集
在基因-基因相關(guān)性（GGC）矩陣中可以觀察到大小不一的相關(guān)性模塊（圖3a），每個模塊可能代表著細(xì)胞中不同的差異表達(dá)模式。為了確保候選特征集中不同細(xì)胞類型的標(biāo)記更均勻的分布，通過在GGC矩陣中進(jìn)行回歸算法（圖3b-d），識別出最具有代表性的最小冗余子集（“seed”基因）。利用這種方法選擇具有不同細(xì)胞類型特異性標(biāo)記的seed基因（圖3e-h），然后通過逐步回歸樹狀圖的拐點來確定最佳步驟數(shù)，也就是seed基因集的大小（圖3i，j）。
圖3 識別最小冗余特征子集的逐步回歸
3. 擴(kuò)展特征集（Guilt-by-association）
基于上述方法選擇的特征集雖然特征表現(xiàn)很顯著，但是每個特征相關(guān)的基因只有少數(shù)幾個基因（大多情況下是2-5個基因），這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此研究人員提出了通過Guilt-by-association的方法來擴(kuò)展特征集，直到DUBStepR達(dá)到特征基因的最佳數(shù)量。
4. 基準(zhǔn)測試
基準(zhǔn)測試是指通過設(shè)計合理的測試方法，選用合適的測試工具和被測系統(tǒng)，實現(xiàn)對某個特定目標(biāo)場景的某項性能指標(biāo)進(jìn)行定量的和可對比的測試。本文研究人員為了測量和評估DUBStepR，將其與其余7種算法在scRNA-seq數(shù)據(jù)中進(jìn)行了比較。每種算法都用了7個數(shù)據(jù)集，涵蓋有4種不同的scRNA-seq：10x Genomics, Drop-Seq, CEL-Seq2和Smart-Seq on the Fluidigm C1。為了評估所選擇的特征的質(zhì)量，這里采用的評估指標(biāo)是SI（Silhouette index），該指數(shù)指的是屬于同一類的細(xì)胞之間的接近度相對于其他類群細(xì)胞的距離。可以發(fā)現(xiàn)，DUBStepR在整個特征集選擇范圍內(nèi)明顯優(yōu)于其他所有方法（圖4a）。此外，DUBStepR在7個數(shù)據(jù)集中的使用，有5個都是在這些算法中排第一的（圖4b）。
為了優(yōu)化細(xì)胞類型聚類，特征選擇算法最好只選擇DE基因，即細(xì)胞類型或亞型特異性基因作為特征標(biāo)記。因此，研究人員量化了特征選擇算法區(qū)分DE和非DE基因的能力，引入了AUROC（ROC曲線下的面積）。圖4c中可以看到，DUBStepR在所有7個數(shù)據(jù)集上的AUROC值都超過了0.97，說明它能夠很好的區(qū)分DE和非DE基因。也就是說，DUBStepR大大提高了我們選擇細(xì)胞類型或亞型特異性基因（DE基因）來對scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類的能力。
此外，研究人員還對DUBStepR進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，以便能以較快的速度可以處理大型數(shù)據(jù)集。
圖4 特征選擇方法的基準(zhǔn)測試
5. 通過DI（Density index，密度指數(shù)）預(yù)測最佳特征集
從圖4a中可以看出，選擇太少或者太多的特征基因都會導(dǎo)致聚類效果不佳。由于無法確定特征集的SI，所以本文研究人員定義了一個新的指標(biāo)，這個指標(biāo)可以大致模擬SI，且無需知道細(xì)胞類型標(biāo)簽；這個指標(biāo)也就是密度指數(shù)（DI），即所有細(xì)胞對之間的均方根距離除以細(xì)胞與其k個臨近細(xì)胞之間的平均距離。
直觀地來說，當(dāng)細(xì)胞聚在一起時，它們之間的距離應(yīng)該最小，DI值應(yīng)該是最大的（圖5a，b）。可以發(fā)現(xiàn)DI和SI確實是呈現(xiàn)正相關(guān)性，并且在大致相同的特征集大小下趨向于達(dá)到它們的最大值（圖5c）。同時，對于7個基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集中的5個，DI最高的特征集也最大化了SI（圖5d）。除此之外，DI還有一個優(yōu)點就是計算相對來說比較簡單。在默認(rèn)條件下，DUBStepR會選擇最大化DI的特征集大小。
圖5 密度指數(shù)
6. DUBStepR在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎樣本中可靠地檢測出罕見細(xì)胞類型和隱匿的細(xì)胞狀態(tài)
前面的定量基準(zhǔn)分析主要基于對健康供體細(xì)胞細(xì)胞系或FACS純化細(xì)胞群中常見的細(xì)胞類型（＞所有細(xì)胞的10%）的檢測。所以研究人員為了證明DUBStepR能夠在復(fù)雜的原始樣本中對細(xì)胞進(jìn)行聚類，這里加入了對四名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者的8312個PBMC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析。首先利用SingleR分離出T細(xì)胞和NK細(xì)胞群（5329細(xì)胞）（圖8），然后通過DUBStepR對這些細(xì)胞進(jìn)行聚類，進(jìn)一步識別出了10個具有顯著不同的基因表達(dá)特征的亞型（圖6a）。其中還包括了四個罕見的細(xì)胞群（圖6b）。總而言之，通過比較其他方法，DUBStepR是唯一一個可以可靠地檢測到淋巴細(xì)胞群中常見和罕見的細(xì)胞類型和亞型的方法。
圖6 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞群分析
7. DUBStepR應(yīng)用于scATAC-seq數(shù)據(jù)
常用的特征選擇通常不適用于scATAC-seq數(shù)據(jù)上，但是特征相關(guān)性卻是適用的。研究人員進(jìn)一步將新的算法DUBStepR推廣應(yīng)用于人骨髓細(xì)胞的scATAC-seq數(shù)據(jù)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DUBStepR的結(jié)果更清楚地揭示了造血干細(xì)胞的三大譜系的出現(xiàn)：淋巴系、髓系和巨核/紅細(xì)胞系（圖7）。具體來說，使用Monocle 3分析得出的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)僅在DUBStepR中與已報道的造血分化層次匹配（圖7d-f）
圖7 已發(fā)表文獻(xiàn)中的scATAC-seq數(shù)據(jù)特征選擇的比較
圖8 SingleR scores熱圖
討論
DUBStepR是一種基于細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因往往彼此之間存在比較好的相關(guān)性的算法。隨著單細(xì)胞技術(shù)的飛速發(fā)展，使得可擴(kuò)展性成為新型單細(xì)胞算法的一個基本特征，而DUBStepR的擴(kuò)展范圍是比較大的，其中的主要因素是一旦構(gòu)建了基因-基因相關(guān)矩陣，下游步驟的時間和內(nèi)存復(fù)雜性相對于細(xì)胞數(shù)量是恒定的。本研究中定義了一個特征空間中細(xì)胞的不均勻性或“聚集性”的度量，也就是密度指數(shù)（DI）。DI的算法相對來說也更簡單。有趣的是，盡管DUBStepR不是專門設(shè)計用于檢測稀有細(xì)胞類型的，但是它的檢測效果要明顯優(yōu)于其他算法。最后，研究人員還推測DUBStep可能也可以用于scATAC-seq、scChIP-seq和單細(xì)胞甲基組測序等數(shù)據(jù)中。
本文所開發(fā)的算法已經(jīng)寫成了R包，源代碼也提供在了GitHub上可供我們獲取。此外，所采用的分析數(shù)據(jù)也是可以直接下載或申請，那我們何不趕緊動動手去用一下這新的算法呢？
