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WGCNA使用非常廣泛，網上流傳的示例代碼也非常多，但還是推薦大家直接參考官方代碼，最全面且權威：https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/Tutorials/index.html
今天不講代碼，只講講這些圖怎么看，能表達什么意義。
WGCNA文章[1]給出了工作流程圖，主要包括：構建共表達網絡→模塊識別→模塊與性狀關聯→模塊相關性→關鍵模塊中識別核心基因
在構建共表達網絡之前，還有一步比較關鍵的步驟——尋找最優軟閾值（soft thresholding或power），使構建的網絡更符合無標度拓撲結構。這時，我們會看到如下圖：
確定最優軟閾值主要參考左圖，即在不同軟閾值（x軸）情況下的無標度擬合指數（scale-free fit index，y軸）。其中紅線表示主觀選擇的無標度擬合指數取值，如圖為0.9，一般我們選擇0.8~0.95之間較為穩妥。從左圖看，當無標度擬合指數在0.9時，符合構建無標度網絡的最小軟閾值為6，因此可以選擇6作為最優軟閾值用于后續分析。右圖為不同軟閾值情況下的網絡連通度。
基于最優軟閾值構建共表達網絡，將基因劃分到不同模塊后，可以繪制基因聚類樹：
這個圖可以分為兩部分看：上半部分是基因的層次聚類樹狀圖，下半部分是基因模塊，也就是網絡模塊。上下對應，可以看到距離較近的基因（聚類到同一條分支）被劃分到了同一模塊。
接著，計算模塊與感興趣的臨床特征之間的相關性與顯著性，繪制相關性熱圖：
上圖中，最左側的顏色塊代表模塊，最右側的顏色條代表相關性范圍。中間部分的熱圖中，顏色越深相關性越高，紅色表示正相關，綠色表示負相關；每個單元格中的數字表示相關性和顯著性。如上圖，brown模塊與weight性狀表現為正相關且相關性最高。此時，我們可以選擇相關性最高的brown模塊作為關鍵模塊。一般，我們會按相關性的絕對值篩選最相關模塊，即負相關模塊也應該考慮在內。需要注意的是，grey模塊中包含了所有未參與聚類的基因，因此是無效模塊，不應用于后續分析。
基于拓撲重疊矩陣，可以繪制基因之間的相關性熱圖。其中顏色越深，說明基因之間的相互作用越強。由于對角線表示模塊內部基因之間的相互作用，所以自然是對角線上的顏色最深：
也可以看看模塊之間的聚類樹和相關性熱圖，探索模塊之間的互作關系：
可以將感興趣的性狀，如weight也加入到圖中。如上圖，可以發現red、brown、blue模塊之間有很強的相關性，甚至比他們與weight之間的相關性更強。
之后針對關鍵模塊brown和感興趣的性狀weight進一步挖掘，看看基因與模塊的相關性（Module Membership, MM）和基因與性狀的相關性（Gene Significance, GS）之間是否有某種關聯。
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通過以上散點圖，可以發現MM和GS呈正相關，說明這些與性狀高度相關的基因，在關鍵模塊中也扮演著舉足輕重的角色。
我們也可以基于關鍵模塊中基因之間的相似性，構建關鍵模塊網絡，以Cytoscape或VisANT軟件可視化展示網絡中基因之間的互作關系：
最后，也是最重要的——基于關鍵模塊篩選核心基因。這一步的可用方法比較多，沒有固定限制。比如，可以根據MM>0.8且GS>0.3篩選核心基因[2]；可以根據關鍵模塊的網絡degree篩選top 30作為核心基因[3]；也可以計算kME值，依據|kME|≥0.7篩選[4]；或者將網絡導入Cytoscape后，利用插件cytoHubba篩選[5]。
參考文獻：
1. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559. Published 2008 Dec 29. doi:10.1186/1471-2105-9-559
2. Song ZY, Chao F, Zhuo Z, Ma Z, Li W, Chen G. Identification of hub genes in prostate cancer using robust rank aggregation and weighted gene co-expression network analysis. Aging (Albany NY). 2019;11(13):4736-4756. doi:10.18632/aging.102087
3. Zhang X, Feng H, Li Z, et al. Application of weighted gene co-expression network analysis to identify key modules and hub genes in oral squamous cell carcinoma tumorigenesis. Onco Targets Ther. 2018;11:6001-6021. Published 2018 Sep 19. doi:10.2147/OTT.S171791
4. Panahi B, Hejazi MA. Weighted gene co-expression network analysis of the salt-responsive transcriptomes reveals novel hub genes in green halophytic microalgae Dunaliella salina. Sci Rep. 2021;11(1):1607. Published 2021 Jan 15. doi:10.1038/s41598-020-80945-3
5. Li CY, Cai JH, Tsai JJP, Wang CCN. Identification of Hub Genes Associated With Development of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma by Integrated Bioinformatics Analysis. Front Oncol. 2020;10:681. Published 2020 May 22. doi:10.3389/fonc.2020.00681
