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癌前病變出現在癌癥發生之前且有助于癌癥的發生，因此了解癌前及癌變階段的異常表型對于探索癌癥發生的分子機制并開發早期診斷及預防策略至關重要。今天小編給大家分享一篇今年3月剛剛發表在Cell Discovery(IF:30.079)雜志上使用單細胞和空間轉錄數據解析口腔鱗狀細胞癌早期及癌前病變的文章。

Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma

口腔鱗狀細胞癌起始過程中癌前病變的單細胞和空間解析

一．研究背景

口腔黏膜癌前病變是口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)發生的重要因素。然而，目前關于癌癥起始階段的細胞組成和空間組織是如何促進人類OSCC發生的仍不清楚。因此小編今天介紹的文章就對OSCC癌前病變及起始階段的細胞形態和作用進行了刻畫，這對理解整個OSCC發生過程至關重要，并有助于制定癌癥治療策略。

二．文章摘要

研究分析了來自9個樣本的極早期OSCC、癌前病變，以及匹配的正常口腔黏膜組織的單細胞轉錄(scRNA-seq)及空間轉錄(ST)數據。結果研究識別出了有利于OSCC發生的異常上皮基因表達。研究也發現不同的成纖維細胞、單核細胞和調節性T細胞亞群都會參與微環境的重塑。此外，研究在癌前病變周圍觀察到一種獨特的免疫抑制性單核細胞亞群和VEGF信號通路的空間轉換調控會共同促進癌癥發生。

三．文章的主要內容及結果

1. 早期OSCC腫瘤、口腔白斑和正常區域活檢樣本的scRNA-seq和ST分析

研究首先對不同區域樣本的scRNA-seq和ST數據進行了介紹。研究收集了9個人的早期OSCC (T)、口腔白斑(DN)及正常區域(N)的10個組織樣本并進行了scRNA-seq分析和ST分析(圖1a、b)。此外，研究分析了蘇木精-伊紅染色(H&E)并由專家標記組織學區域的圖像數據(圖1c)。經過質控后，RNA-seq共分析了52721個細胞，其平均測序深度為43905個讀數(reads;圖1d-f)。接下來研究在表達標化和主成分分析(PCA)后，將這些細胞聚類成11個亞群，并根據標記基因對這些亞群進行了注釋(圖1d-f)，其中包括口腔上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、B/漿細胞、髓系細胞、T細胞、肌細胞等(圖1d，e)。此外，研究在ST分析中對26773個斑點(spot)進行了測序，且對N、DN、T和薄層區域的ST數據進行細胞類型標記評分，并在熱圖中展示了細胞類型的占據和富集情況(圖1g)。研究觀察到ST數據中排名最高的是上皮細胞，其次是成纖維細胞，髓系細胞和T細胞(圖1g)，進一步研究也在P1樣本中展示了特定細胞類型標志物的代表性表達特征(圖1h)。

2. 上皮細胞的高拷貝數變異(CNV)、FRA和mTORC1信號評分與OSCC發生的相關性

這一部分研究對上皮細胞與OSCC發生的關聯進行了分析。研究首先對上皮細胞進行了重聚類，分為C1和C2兩部分(圖2a)，其中大多數亞群位于C1，一小部分亞群分散分布于C2，且C2中的大部分細胞來自T區域(圖2a)。接下來為了區分惡性細胞和非惡性細胞，研究對上皮細胞進行了拷貝數變異（CNVs）推斷，結果發現DN和T區域的上皮細胞中CNV逐漸富集(圖2b)。接下來研究在ST中觀察到DN和T區域富集糖酵解、缺氧和DNA錯配修復等經典癌癥通路和標志物(圖2c)。此外，研究也在scRNA-seq中觀察到EMT、mTORC1、FRA通路在OSCC發生過程中(從N、DN到T組)逐漸富集(圖2d)，ST數據也揭示了FRA和mTORC1通路相似的變化趨勢(圖2e, c)。研究也通過細胞互作分析發現在N階段基質細胞和上皮細胞之間很少有相互作用。然而，從DN期到T期，上皮細胞和周圍基質細胞之間頻繁的交互，表明DN期上皮細胞的表達和相互作用發生了巨大的變化(圖2f)。

3. 識別參與調控OSCC起始過程的起始相關上皮標志物

這一部分研究對參與OSCC起始的上皮細胞標記物進行了介紹。研究首先識別了在OSCC起始過程中上皮細胞中逐漸上調的基因，并將其稱為“起始相關”基因(圖2g)，結果在scRNA-seq數據中識別了8個起始相關基因，同時研究使用ST數據對這些基因進行了確認，這8個基因分別為CTSC、FADD、ITGB4、LGALS1、LY6K、PMEPA1、TFAP2A和TGFβI(圖2h, i)。接著研究通過ST特征圖和組織學染色證實TFAP2A在上皮細胞中的表達隨著OSCC的發生而逐漸增加(圖2j, k)。進一步研究在體外類器官中敲低TFAP2A后，發現增殖速度減慢，其他啟動相關基因的表達也降低(圖2l, m)。

4. Mesen_CAF亞群主導OSCC的起始并且在空間上更接近上皮細胞

這一部分研究對成纖維細胞進行了分析。研究首先將成纖維細胞分為三個亞群:Mesen_CAF、Infla_CAF和cycling_CAF(圖3a)。結果觀察到Mesen_CAF亞群細胞外基質(ECM)基因(ASPN、POSTN和TNC)和促進間充質的TF (TWIST2)高表達(圖3b)，且同時富集非經典WNT通路(APCDD1, PMEPA1和WNT5A)和趨化因子標志物(CCL2和IL1R1)(圖3b)。而Infla_CAF亞群富集經典基質細胞衍生因子CXCL12，并高表達激素和代謝相關標志物(IGF1和CFD)(圖3b)。Cycling_CAF則為較小的群體，富集于細胞增殖相關的MKI67、CDK1和UBE2C基因。研究也觀察到這些亞群都表達經典的CAF標記物(圖3c, d)。ST和標記染色數據分析也發向在OSCC起始期間，Mesen_CAF標記物表達呈逐漸增加的趨勢(圖3e-g)，并廣泛分布于上皮區域，這表明Mesen_CAF可能參與上皮細胞癌變過程(圖3e、f)。研究進一步對這兩個成纖維細胞亞群的富集分析也發向Mesen_CAF富集于TGFβ， EMT，血管生成和PI3K-AKT-mTOR通路，這些通路之前已經被報道對癌癥的發展至關重要，這意味著其在OSCC發生的微環境塑造中具有潛在的作用(圖3h)。

5. Mono_INHBA亞群在DN期頻繁與CAFs、耗竭T細胞和上皮細胞相互作用

這一部分研究對腫瘤的免疫微環境進行了分析。研究首先使用ST數據分析了免疫細胞的分布，結果發現，LYZ(髓系細胞標記)和CD14(單核細胞標記)富集在全組織切片或切片的DN和T區域(圖4a, b)。在髓系細胞亞群，研究觀察到DC細胞表現出HLA^-DRs⁺和CD14^-特征(圖4c)，單核細胞高表達CD68和CD14(圖4c)。其中Mono_INHBA和Mono_NLRP3為經典的CD14⁺ CD16 ^-單核細胞，并高表達單核細胞標志物S100A8、S100A9和VCAN(圖4d)。作者根據CD16、CD163和MRC1識別了巨噬細胞，并根據特異標志物將巨噬細胞分為Macro_SELENOP、Macro_APOE和Macro_NRG1三個亞群。scRNA-seq數據分析發現DN區域中Mono_INHBA亞群的平均比例最高，不過有兩個個體的Mono_INHBA總體較低(圖4e)。研究也通過多重免疫組織化學(mIHC)染色進一步驗證了Mono_INHBA的富集在DN階段(圖4f)。研究也觀察到Mono_INHBA富集到M2樣免疫抑制和血管生成活性(圖4g)。此外，研究發現Mono_INHBA在空間上更接近耗竭的CD8⁺ T細胞(CD8⁺ Tex)，并且它們通過CSF1-CSF1R相互作用(圖4h)，且Mono_INHBA也通過CD274-PDCD1和PVR/ NECTIN2-TIGIT與CD8+ Tex相互作用，促進DN區域的免疫耐受(圖4g, i)，Mono_INHBA也與CAFs通信，從而調節其膠原形成和其他間質活性(圖4j)。進一步研究通過在口腔白斑類器官中添加THBS1來模擬相互作用，觀察到THBS1會促進上皮細胞的增殖和起始相關基因的表達(圖4k, l)。

6. Cluster 2-Mesen_CAF、Macro_APOE/NRG1和TNFRSF4⁺ Treg亞群參與DN向T分期的轉變

這一部分研究對觸發OSCC發病過程及構成因素進行了探索。研究首先觀察到從DN到T每個個體中Mesen_CAF Cluster 2都在T區域明顯增加(圖5a)，該亞群中間充質祖細胞和基質活化標志物高表達(圖5b)，在ST數據中也一致(圖5c)。此外，研究也發現在每個個體中，從DN到T階段，Macro_NRG1和Macro_APOE的比例增加，在ST數據中也觀察到類似的趨勢(圖5d, e)。研究在scRNA-seq數據中也發向Macro_NRG1和Macro_APOE富集到ROS和血管生成通路(圖4g)。ST數據分析則發現M2樣巨噬細胞和血管生成通路從DN到T分期呈增加趨勢(圖5e)。此外，研究也發向這兩種亞型的細胞比例與上皮細胞中CTSC的表達水平高度相關(圖5f)。這表明上皮細胞CTSC的表達升高可能是Macro_APOE/NRG1募集或分化的原因。研究也發現TNFRSF4(OX40)是FOXP3⁺和CD25⁺ Treg亞群之間的顯著DEGs(圖5g)，此外它在IL2-STAT5信號通路中富集(圖5h)。ST數據也證實了在OSCC起始階段，TNFRSF4⁺ Treg細胞及TNFRSF4表達呈上升趨勢(圖5i, k, l)。研究也觀察到CD8_Tem與TNFRSF4⁺ Treg細胞的比例從N階段到T階段保持穩定或逐漸下降(圖5j)。此外沒研究在早期OSCC樣本中對APOE, CD68, FOXP3和OX40的mIHC染色進一步驗證了這些免疫細胞參與了DN向T階段的轉變過程(圖5m)。

7. DN期存在VEGF信號通路的空間轉換調控

這一部分研究對經典癌癥通路VEGFA進行了分析。研究首先通過細胞互作分析發現上皮細胞分泌的VEGFA自DN階段起就與基質細胞上的受體相互作用(圖6a)。從OSCC起始組織的VEGFA染色中，研究觀察到VEGFA在N區和DN區上皮的上層高表達(圖6b)。接著研究在病理專家的指導下，根據角化過度和不典型增生將N和DN區上皮分為兩部分，分別為上皮的上下層(圖6c)，結果研究發現與N和DN區域的下層相比，VEGFA信號在上層表現出顯著的表達增強(圖6d, e)。除了VEGFA信號外，研究也在N區和DN區上層觀察到了CD68⁺細胞和CD68⁺ VEGFA⁺信號(圖6f, g)。

8. 確定的免疫亞群在OSCC發病中的臨床相關性

在文章的最后一部分研究對免疫亞群在OSCC發病中的臨床相關性進行了分析。研究首先通過mIHC染色證實初發輕度白斑和伴中重度異型增生白斑的微環境中，CD68⁺和APOE⁺巨噬細胞、FOXP3⁺和TNFRSF4⁺Tregs、VEGFA和TGFβ信號的表達水平不同(圖7a, b)，其中初發白斑的微環境中，TGFβ信號的表達水平較低，淋巴細胞浸潤有限(圖7a)，相反中度至重度不典型增生的活檢中CD68⁺及VEGFA⁺單核細胞、TNFRSF4⁺ Treg以及VEGF和TGFβ1信號則增強(圖7b)。接下來，作者在小鼠中建立了癌變模型來探索這些細胞亞群的功能(圖7c)。研究發現腹腔注射抗TGFβ和抗PD-1抗體的小鼠在20周時要么表現出肉眼可見的菜花樣病變，要么在舌頭上表現出相對粗糙的表面(圖7d)。在對每組的菜花狀病變進行定量后，作者發現所有治療組與未治療組相比，顯著地表現出較輕的病變，表明這些抗體對OSCC起始具有干預作用(圖7e, f)。

到這里這篇文章的主要內容就介紹完了。文章聚焦于口腔鱗狀細胞癌的早期階段，納入了單細胞轉錄及空間轉錄數據，將生信分析與實驗相結合，對觸發癌癥發生的因素及癌癥早期的微環境進行了全面分析，內容豐富邏輯清晰，值得我們參考學習。